氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立

河北农业大学硕士学位论文氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立姓名：宋洁申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：孙继国20060617氯霉素全抗原合成的研究及间接ELISA检测方法的建立作者：宋洁学位授予单位：河北农业大学相似文献(10条)1.学位论文程芬氯霉素和莱克多巴胺人工抗原合成及鉴定研究2009氯霉素（CAP）是一种广谱高效的抗生素，因其高效价廉，曾作为细菌性疾病的治疗药物广泛应用于人和动物临床及畜牧业生产，但由于其具有严重的毒副作用，长期微量摄入氯霉素将会导致抵抗力下降感染各种疾病。莱克多巴胺（RCT）是一种β2-肾上腺素受体激动剂。最初在临床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。大剂量使用时具有改变动物的营养代谢，降低机体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率的作用，因而被不法商人用于做饲料添加剂。RCT在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁。本文进行了莱克多巴胺和氯霉素的人工抗原的合成及ELISA检测方法的建立等方面研究，先用莱克多巴胺、氯霉素分别与载体蛋白牛血清蛋白（BSA）合成了免疫抗原，与载体蛋白卵清白蛋白（OVA）合成了包被抗原，再经紫外、红外光谱、凝胶电泳实验证明半抗原与载体蛋白是否偶联成功。研究结果表明：氯霉素人工免疫抗原红外光谱图中3425.7cm-1处出现O-H伸缩振动吸收峰，1641.2cm-1和1376.5cm-1出现了C=O和C-N特征吸收峰，说明生成了酰胺；1000～1200cm-1出现的宽且强的酚的C-O伸缩振动吸收峰，而BSA的IR中并无此吸收峰，表明合成的人工抗原红外光谱图中具有蛋白质和CAP的特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中保留了氯霉素在226nm处的特征吸收峰，在276nm处也出现了特征吸收峰，说明人工抗原紫外光谱图中呈现CAP和牛血清蛋白的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的CAP人工免疫抗原上偶联了30个CAP小分子，合成的CAP人工包被抗原上偶联了37个CAP小分子。莱克多巴胺人工免疫抗原红外光谱图中呈现了蛋白质类共有的吸收，如3306cm-1的胺基N-H吸收峰、1653cm-1的酰胺谱带和1536cm-1的酰胺谱带。RCT人工抗原在1000～1300cm-1出现了RCT与BSA偶联后的C-N伸缩振动吸收峰，而BSA的中并无此吸收峰，说明人工抗原红外光谱图中呈现RCT和牛血清蛋白的红外特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中BSA-RCT最大吸收峰特征波长为276nm，RCT、BSA的特征波长分别为274nm和278nm，说明人工抗原紫外光谱图中具有蛋白质和RCT的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的RCT人工免疫抗原上偶联了24个RCT小分子，合成的RCT人工包被抗原上偶联了30个RCT小分子。用氯霉素人工抗原免疫母鸡制备抗氯霉素多克隆抗体，根据棋盘滴定抗体效价为64000，抗体的最适工作浓度为1：1500，抗原最佳包被浓度为5μg/mL，确定最佳包被条件为37℃下温育1小时，然后4℃下包被12小时，用间接竞争ELISA法检测一系列浓度的CAP溶液，发现有20％的抑制率，证明氯霉素人工抗原合成成功。通过免疫Balb/C小鼠制备了莱克多巴胺多克隆抗体，抗体效价为192000，抗体最适工作浓度为1：6000，最佳包被浓度为1μg/mL，通过优化实验，确定最佳包被条件为37℃下温育1小时，然后4℃下包被12小时。间接竞争ELISA法测定莱克多巴胺结果表明莱克多巴胺浓度在102～1×105μg/L范围之间曲线呈良好的线性关系，线性回归直线方程为y=0.2538x-0.3331，相关系数r=0.9787。莱克多巴胺的检测范围为126～29141μg/L，抑制率为50％时对应的莱克多巴胺浓度为1905μg/L。2.期刊论文方伟.胡鲲.姜有声.黄宣运.杨先乐.FANGWei.HUKun.JIANGYou-sheng.HUANGXuan-yun.YANGXian-le氯霉素人工抗原的合成与鉴定-华中农业大学学报2009,28(3)采用重氮化法和碳二亚胺(EDC)法合成了氯霉素人工抗原.经紫外光谱法、电泳鉴定表明偶联成功;采用三硝基苯磺酸法测得载体蛋白ε-NH3+残基利用率分别为31.02%、22.27%,偶联物的结合比为18.9、13.6;制备的抗原分别免疫小白鼠获得多克隆抗体,血清效价可达10-6以上.经比较,碳二亚胺法更适于氯霉素人工抗原的制备.3.学位论文徐修远氯霉素抗体的制备与间接竞争ELISA检测氯霉素残留的初步研究2004在集约化畜牧业生产发展的同时,应用药物诊断、预防和治疗动物的疾病显得十分重要,用于促进动物生长、同步发情、提高生产量等非治疗用途的药物品种和数量不断地增加,由此而伴随产生的动物组织和产品中的药物残留(drugresidue)对公众健康和环境的潜在危害也日趋严重.氯霉素(CAP)是第一个人工合成的广谱抗生素,因其效价高,价格低廉,在我国畜牧业中得到广泛应用,成为畜禽疾病防治的重要药物.随着氯霉素的广泛应用和研究,发现其有毒、副作用,相随而来的是氯霉素在动物组织中的残留危害问题,在逐渐认识中,其残留检测受到广泛关注,快速检测氯霉素在动物体的残留成为畜牧生产实践中亟待解决的重要问题.氯霉素是小分子半抗原,缺乏免疫原性.将半抗原与合适的载体蛋白偶联后,半抗原可以成为全抗原并具有较好的免疫原性;本研究以牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)为载体,采用重氮化法,合成氯霉素(CAP)的两种免疫偶合物免疫原CAP-BSA和包被抗原CAP-HAS;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联是否成功.用上述两种偶联物分别作为免疫原与包被原进行抗血清制备及ELISA试验,结果产生了特异性抗体.交叉试验表明:产生的特异性抗体与氯霉素反应明显,与其他类似物交叉反应不明显.用上述获得的抗体对兔肉中氯霉素残留进行了间接竞争ELISA模拟检测,确定了间接竞争ELISA检测兔肉中氯霉素残留方法,测定的基础是竞争性酶联免疫反应,游离氯霉素与氯霉素辣根过氧化物酶标记物在同一系统中竞争数量有限的氯霉素抗体结合位点,氯霉素酶标记物与氯霉素抗体结合的数量反比于游离氯霉素的数量,以OPD-H,2O,2为底物,测量490nm波长的吸光度值,按标准曲线计算样品中的氯霉素含量.本方法的测定低限为20ng/mg,特异性试验显示与5个类似物交叉反应率小于0.01％,此间接竞争ELISA法测定氯霉素的标准添加回收率大于80％,平均变异系数CV％(n=3)为6.56,与HPLC法分析结果基本吻合,方法的准确度和精密度符合残留分析的要求.以上试验的结果表明:此间接竞争ELISA法符合目前国际上氯霉素残留量检测的要求.4.期刊论文邢淑婕.徐固华.王琴.XINGShu-jie.XUGu-hua.WANGQin氯霉素人工抗原的合成-食品科技2007,32(10)以重氮化法分别将氯霉素(chloramphenicol,CAP)与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)及卵清白蛋白(ovaibumin,OVA)进行偶联,得到复合物CAP-BSA和CAP-OVA.对复合物紫外扫描显示其扫描谱图与BSA和氯霉素的图谱有明显的差异,BSA及OV与氯霉素偶联成功.分析CAP-BSA中CAP与BSA的摩尔比,偶联时,CAP与BSA的起始质量比为1:1、1:2、2:1时,偶联物中CAP:BSA摩尔比分别为4.69:1、8.90:1、7.94:1,说明反应起始时不同的CAP与蛋白质配比会对偶联效果有较大的影响.以摩尔比为8.90:1的CAP-BSA免疫BALB/c小鼠65d后,间接ELISA检测测定效价达1:20000.5.学位论文李友杰抗头孢噻呋多克隆抗体和抗氯霉素多克隆抗体制备的研究2008头孢噻呋作为第一个动物专用的头孢菌素类抗生素，由于其在兽医临床上的日益广泛使用，其在动物性食品中的残留也逐渐引起人们的高度关注，快速检测头孢噻呋在动物性食品中的残留成为畜牧生产实践中亟待解决的问题。氯霉素是第一个人工合成的广谱抗生素，因其效高价廉，在我国畜牧业中得到广泛应用，成为畜禽疾病防治的重要药物。随着氯霉素的广泛应用及研究的深入，发现其有许多严重的副作用，因此，必须控制氯霉素在动物性食品中的残留，建立一种快速检测氯霉素残留的方法。本研究采用免疫学技术，成功制备抗头孢噻呋多克隆抗体和抗氯霉素多克隆抗体，并初步建立了检测头孢噻呋和氯霉素在动物性食品中残留的ELISA方法，为其单克隆抗体的制备和试剂盒的开发打下了良好的基础。主要研究内容如下：1.成功制备了抗-CEF多克隆抗体1.1采用直接法将头孢噻呋(CEF)与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别合成免疫抗原(CEF-BSA)和检测抗原(CEF-OVA)，用紫外(UV)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行鉴定，并用正交分解法优化了抗原合成过程。1.2用CEF-BSA免疫Balb/c小鼠得到抗CEF多克隆抗体，间接ELISA检测抗血清的效价为1:135000，间接竞争EIASA测定CEF的标准曲线，线性范围为100ng/mL-1000ng/mL，线性方程是y=-2.6x+206.0，相关系数(r)为0.98，IC50是206.0ng/mL，检测限为49.1ng/mL，以200ng/mL-800ng/mL，浓度添加时，牛奶中的回收率为79.2％-94.5％，变异系数为5.1％-13.4％。2.成功制备了抗-CAP多克隆抗体2.1将氯霉素(CAP)和琥珀酸酐合成半抗原琥珀酰氯霉素(CAP-HS)，然后在碳化二亚胺(EDC)作用下与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别合成免疫抗原(CAP-BSA)和检测抗原(CAP-OVA)，用紫外(UV)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行鉴定，并用正交分解法优化了抗原合成过程。2.2用CAP-BSA免疫家兔和Balb/c小鼠都得到抗CAP多克隆抗体，间接ELISA检测抗血清的效价为1:162000，间接竞争ELISA测定CAP的标准曲线，线性范围为10ng/mL-100ng/mL，线性方程是y=4.3x+32.4，相关系数(r)为0.98，IC50是32.4ng/mL，检测限为0.94ng/mL，以20ng/mL-100ng/mL浓度添加时，鸡蛋中的回收率为79.4％-98.5％，变异系数为0.5％-4.3％。6.会议论文宋洁.孙继国.王铮.尹卫卫三种氯霉素全抗原合成方法的比较及鉴定2006通过化学方法合成了氯霉素(CAP)人工免疫原,采用重氮化法、混合酸酐法及碳二亚胺法将半抗原氯霉素分别与载体蛋白BSA连接制备人工免疫原,经紫外分光光度法计算出偶联率,绘制紫外图谱、SDS-PAGE电泳和动物免疫试验证实人工抗原合成成功.重氮化法、混合酸酐法及碳二亚胺法偶联得到了其免疫原计算结合比分别为17.5:1、18.3:1和11.2:1,所以混合酸酐法在用于氯霉素全抗原合成效果较好.这对氯霉素多克隆抗体、单克隆抗体的制备具有重要意义。7.学位论文孙法良氟苯尼考、安普霉素药物残留的ELISA检测方法研究2009氟苯尼考和安普霉素分别属于氯霉素类和氨基糖苷类抗生素，目前在临床上应用十分普遍。并且两者在畜禽组织中的残留都会引起一系列后果。酶联免疫检测法(ELISA)是一种简便、快速，并非常适合大规模样品筛选的检测方法，但国内主要依靠价格昂贵的进口试剂盒。研制自主产权的快速检测ELISA试剂盒，已成为当务之急。因此，针对二者残留的快速检测方法的建立对控制动物性食品的质量等方面具有重要的社会和经济利益。本论文旨在建立畜禽产品中氟苯尼考和安普霉素残留的间接竞争酶联免疫吸附(ci-ELISA)检测方法。研究内容和结果如下：实验一氟苯尼考和安普霉素人工抗原的合成及鉴定采用混合酸酐法，将氟苯尼考分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联；采用碳化二亚胺法将安普霉素与BSA偶联、戊二醛法将安普霉素与OVA偶联；制备出四种人工抗原FFC-HS-BSA、FFC-HS-OVA、Apra-BSA和Apr