组织培养的基本设备和无菌操作（PDF69页）

第二章植物组织培养的基本设备和无菌操作组织培养实验室的组成组织培养的基本设备组织培养所需的环境条件组织培养的无菌操作本章主要内容第一节组织培养实验室的组成组织培养实验室基本实验室辅助实验室基本实验室洗涤室配制室灭菌室无菌操作室培养室驯化移栽室辅助实验室用于细胞学、组织学观察。组织培养室基本设置温室观察室接种室缓冲室灭菌室培养室培养基配制化学实验室洗涤室组培室分区布局第二节组织培养的基本设备玻璃器皿培养容器培养容器盛装容器计量容器器械用具接种工具仪器与设备培养箱培养箱空调、加热器高压灭菌锅高压灭菌锅冰箱、冰柜振荡培养箱摇床电子天平酸度计显微镜显微镜水浴锅纯水系统超净工作台超净工作台试剂柜培养基配制器具培养基配制器具培养架温室大棚第三节组织培养所需的环境条件1、温度2、光照3、湿度4、气体5、培养基渗透压6、培养基的pH值组织培养所需的环境条件温度是植物组织培养成功的关键因素，温度最重要的作用是决定呼吸速率和控制植物组织代谢过程的化学反应。为保持一定的温度，培养室一般要求较好的密闭条件，由空气调节器调节室温。最适温度温度处理1、温度最适温度一般植物生长的适宜温度在25±2℃之间。例外：倒挂金钟22~24℃生长最好，温度升高生长放慢甚至完全停止。温度不仅对增殖，对器官的形成也有影响。可能与温度调控内源细胞分裂素代谢系统有关。例如：烟草芽的形成以18℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率很低。温度处理的影响在植物组织培养前，先对培养材料进行不同温度处理，往往起到诱导和促进生长的作用。例如：胡萝卜切片进行4℃，16~32min的低温处理，比不处理的生长大大加快。天竺葵10℃低温处理茎芽分化优于20℃和30℃菊芋块茎组织的低温和高温处理均可促进生根。光照是组织培养中的重要条件。由于植物组培是在含糖培养基上进行的，因此光照的主要作用是在形态建成的诱导方面。它对细胞、组织、器官的生长及分化发生作用。光周期光照强度光质2、光照光周期大多数植物对光周期是敏感的最常用的光周期：16h光照＋8h黑暗园艺上常用：12h光照＋12h黑暗林木商品化组培：22h光照＋2h黑暗至24h光照光周期对植物形态建成影响显著例如：天竺葵：15h～16h光照下，愈伤组织诱导芽形成最多敏感型葡萄品种：其茎切段在短日照下形成根，长日照下形成愈伤组织。光照强度对植物细胞增殖和器官分化有重要影响，尤其对外植体细胞的最初分裂有明显的影响。最常用的光照强度：1000～5000（lx）但不同植物组织培养的最适宜光强有差异例：玉簪花芽愈伤组织的诱导率暗培养下比光照下高，花茎培养则只有暗培养才能诱导愈伤组织的形成。菊芋地茎试管苗发根，每天1h600lx的光照对发根有促进作用，每天12h则达到最好限度，照射时间再增加其效果没有变化。光质对愈伤组织诱导、组织培养增殖、器官分化有明显影响。不同植物组织培养对光质要求有差异。例：杨树：红光促进愈伤组织的生长、蓝光有阻碍作用松树：红光对子叶上芽的诱导效应最大，全紫光或近紫光无效。应针对不同植物种类，不同培养阶段，根据不同培养目的，选用合适的光质照明。最常用的光源：日光灯（可安装继电器或定时钟，根据需要自动控制照明时间）组培苗移栽前生长在容器内，其湿度主要受培养基的影响，相对湿度接近100%。培养环境的湿度一般要求70～80％以防止培养基水分散失，湿度过低会导致培养基水分蒸发、提高培养基的渗透压、改变培养基营养成分的浓度。试管苗移栽时受环境湿度影响最大，为了提高成活率，生产中常采用覆盖、喷雾等措施，使试管苗安全度过缓苗期。3、湿度氧气为细胞生命活动所必需固体培养时应有部分组织与空气接触液体培养可采用振荡培养解决通气问题培养瓶要适当透气，以解决培养过程中产生的乙烯等对培养物的影响。4、气体培养基渗透压影响着植物细胞脱分化、再分化及器官的形成。培养物是通过培养基的渗透压来吸收水分和养分的，只有培养材料和培养基之间处于等渗或略低于培养基的渗透压时，培养材料才可能从培养基中吸收养分和水分。蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、聚乙二醇等都可影响培养基的渗透压。培养基中一般多用蔗糖，多数植物的适宜浓度在2％～6％；根分化一般用2％～3％；体细胞胚胎发生需较高的糖浓度，最高用到15％。5、培养基的渗透压pH值直接影响培养材料对营养物质的吸收，从而影响新梢的生长、繁殖。不同植物对培养基pH值的要求不同，通常在5.0～6.5之间。一般培养基的pH值调整在5.6～5.8之间，基本能适应大多数植物的需要，特殊的植物要经过试验来确定。6、培养基的pH值第四节组织培养的无菌操作无菌操作是组织培养的关键技术，其中最重要的是培养基、接种工具、器皿及环境的消毒处理；如果环境、介质近乎无菌，那么人为操作技术引起污染的可能性会大大降低。一、常用的灭菌方法干热灭菌法湿热灭菌法过滤灭菌烧灼灭菌药剂灭菌熏蒸灭菌照射灭菌干热灭菌法利用烘箱烘烤灭菌，温度控制在160~180℃，2~3小时。此法适用于各种玻璃器皿和金属器械的灭菌。要把预先灭菌的物品洗净并妥善包扎，然后放入箱内，以免灭菌后取用时重新污染。湿热灭菌法利用高压蒸汽实现灭菌，高压锅密闭环境使蒸汽压力随着加热而上升，压力上升使水的沸点升高。一般培养基灭菌在121℃，20min左右；无菌水、器械、棉塞等30min左右可达到灭菌效果。用于抽滤灭菌的滤膜、针管等也以高压蒸汽灭菌好。高压灭菌锅高压灭菌锅高压蒸汽灭菌应注意如下问题：彻底排除锅内冷空气高压蒸汽锅不可装得过满使用高压锅必需严格按要求操作严格遵守灭菌时间过滤灭菌原理是空气或溶液通过过滤滤膜后，杂菌的细胞和孢子因大于滤膜孔径而被阻，从而使过滤的空气或液体实现无菌状态。主要用于对高温、高压不稳定，遇热易分解的物质的灭菌。烧灼灭菌主要用于金属器械的灭菌，一般将与接种材料直接接触的部分，在酒精灯的外焰上灼烧充分，直至尖端部分烧红为止，可有效杀菌。或使用高温灭菌器。药剂灭菌适用于外植体的表面灭菌，常用药剂有升汞、酒精、双氧水、来苏水、漂白粉、次氯酸钠等；也用于培养室、接种室或其他实验室灭菌，如常用新洁尔灭、70%酒精液体喷洒培养室，可有效杀死空气中的各种杂菌并降尘。熏蒸灭菌甲醛、高锰酸钾、福尔马林等，常用于培养室、接种室或其他实验室灭菌。照射灭菌紫外光灯照射，常用于培养室、接种室及超净工作台的灭菌。直接、简易，但对人体有伤害。二、无菌操作1、清洗器皿的清洗试验材料的清洗2、植物材料灭菌3、接种①无菌室和超净工作台的清洁和灭菌用75％的酒精棉球擦拭台面；紫外灯照射15-20min，同时打开风机送风半小时左右。②工作人员双手的清洁和消毒：用肥皂洗净双手，操作前用75％的酒精棉球擦手。经常清洗接种服、帽子、口罩。③接种过程操作规范:接种工具使用一次灭菌一次；打开瓶盖时要避免污染瓶口；防止灰尘落入瓶中；接种时应在酒精灯安全区内操作。经常擦手，避免接触带菌物品。本章复习重点了解植物组织培养实验室的基本构成及所需的仪器设备；熟悉植物组织培养所需的环境条件；了解常用的灭菌方法，掌握高压灭菌锅的使用（结合实验课）；掌握无菌操作的要点（结合实验课）。