高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化(李金明)

高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化李金明国家卫生计生委临床检验中心全国cfDNA检测标准化高峰论坛2016.11.23-24长沙基因测序技术的发展1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学JamesWatson和FrancisCrick）1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学RoberHolley，小片段重叠法）1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred）1977年：Sanger测序（英国剑桥大学FredSanger）和Maxam-GillbertDNA化学降解法测序(美国哈佛AlanMaxam&WalterGilbert）1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所RonaghiM等）2005年:GenomeSequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454lifeScience公司的创始人JonathanRothberg)2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术（next-generationsequencing）2007年被NatureMethods评为生物领域影响力最大的技术精准医学不等于高通量测序高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术高通量测序技术的临床应用染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（PreimplantationGeneticDignosis，PGD）肿瘤靶向治疗基因突变检测单基因遗传病检测病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序┈┈高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛2016年质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测2017年正式开展：全国肿瘤基因突变高通量测序（组织样本）检测质评计划批准的第一批四个专业的试点单位全面质量管理？写你所应做的做你所写的记录你已做的分析你已做的以ISO的标准如ISO15189为标志的！标准化？标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。标准化＋全面质量管理！病原体核酸标准物质的单位IU（InternationalUnit）/mL有关标准品单位和溯源的问题长度单位的确定和溯源举例火箭助推器宽度和铁轨间距（4.85英尺)的溯源现代铁路铁轨间距4.85英尺英国电车轮轨间距的标准马车轮距的标准英国马路辙迹的宽度是4.85英尺罗马战车的宽度牵引一辆战车的两匹马的屁股的总宽度铁轨的宽度决定了铁路上隧道的宽度美国航天飞机的火箭助推器的宽度“英尺”的由来？FootFoot最初是一个成人的脚长？德国人异议：因人而异16个男子左脚长度的均值实验室医学（laboratorymedicine）70%或90%以上信息来自实验室诊断监测预后预测个体化医学（personalizedmedicine)精准医学（precisionmedicine）移动医疗数字医疗质量管理与标准化？实验室医学的时代！没有精准检测何来精准医疗？精准医学计划（PrecisionMedicineInitiative）新生儿测序计划（BabySeqProject）标准化的关键点检验申请单是合适的：对“Who”在“When”开出“What”申请单标本是正确的和好的：采集、运送和保存实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的避免（分区、灰尘、电磁、振动等）仪器设备状态是好的：维护、定期校准试剂是好的：性能验证或性能确认、批质检实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力评估SOP的可操作性及全员遵循得到结果的过程是有监控的：室内质量控制和室间质量评价（或实验室间比对）针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质量持续改进临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗质量保证检测申请单、标本采集、运送和保存（分析前）室内质控（分析中）室间质评（分析中）结果报告解释及临床应用（分析后）涉及临床医生标本采集环节和实验室涉及实验室涉及实验室涉及实验室人员和临床医生国家卫生计生委高通量测序试点实验室要求基本要求（1）1.试点实验室应在国家卫生计生委批准的试点专业范围内开展临床检测工作。2.试点实验室需采用高通量测序开展不少于一项的检测项目。基本要求（2）3.为避免污染所致的假阳性结果，各试点实验室应根据所开展的检测项目进行分区，具体各专业实验室的分区要求由国家卫生计生委临床检验中心负责发布。实验室分区设计的标准化产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区标本与文库制备区文库扩增与检测区测序区植入前胚胎遗传学诊断(全基因组低拷贝测序)缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区WGA制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区扩增一区遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库扩增区（扩增二区）标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间试剂准备•试剂制备、贮存；•消耗品准备、贮存标本及文库制备•核酸提取（磁珠或柱提）及片段化及其检测（组织样本，可单设打断区，检测可在电泳区）•末端修复和加“A”•接头（adapter）连接：连接产物磁珠纯化（加标签index）扩增一区•纯化产物的PCR扩增（一次扩增）杂交捕获区•扩增产物纯化，Qubit检测文库浓度，Agilent2100检测文库片段大小（可在电泳区完成）•磁珠法纯化连接文库产物，文库pooling•杂交捕获，洗脱扩增二区•前述杂交捕获产物进行PCR扩增富集，Agilent2100检测文库片段大小（可在电泳区完成）•PCR检测文库浓度•测序前文库pooling测序（一代、二代）•上机测序（2hr）•数据分析（Keysignal、Totalreads、Usablereads、Polyclonal与低质量序列在合理范围内、测序长度、测序深度、在靶率、扩增不均一度等）Illumina平台杂交捕获法肿瘤基因突变NGS检测流程举例Illumina平台杂交捕获法肿瘤基因突变NGS检测流程举例DNA打断区缓冲间缓冲间杂交捕获区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊标本与文库制备区试剂准备区文库检测区测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间文库扩增区（扩增一区）空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊杂交捕获区标本与文库制备区试剂准备区捕获产物扩增富集区（扩增二区）测序区电泳区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间PCR产物建库测序（如HLA/HPV…）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊文库检测区标本制备区试剂准备区缓冲间缓冲间空气流向空气流向电泳区PCR扩增与文库构建区试剂准备•试剂制备、贮存；•消耗品准备、贮存标本制备•核酸提取（磁珠或柱提）多重PCR及相物消化•多重PCR（所需片段扩增，～200bp•引物消化建库•加adapters或BarcodeAdapters（可有96种，一人份一种）•磁珠法纯化连接文库产物•文库定量•pooling测序前扩增•Onetouch上扩增（60cycles，油包水，引物上加biotin）•碱变性，包被有亲合素磁珠吸附生物素化的单链测序（一代、二代）•上机测序（2hr）•数据分析（Keysignal、Totalreads、Usablereads、Polyclonal与低质量序列在合理范围内、测序长度、测序深度、在靶率、扩增不均一度等）PGM或IONPROTON平台肿瘤基因突变检测为例关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区高通量测序实验室设计需注意的几点电泳区：DNA提取、DNA片段化后大小鉴定等步骤需要用到电泳，单独成区，但不同的检测项目可以共用该区域。测序区：应为恒温恒湿实验室，2小时温度波动应小于2℃。分区设置可根据自动化仪器设备引入做适当流程、区间整合。无创产前筛查实验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为防止污染，不能与其他项目的标本制备区共用。其他：实验室通风换气（10次/小时）、生物安全柜等要求普通基因扩增实验室。基本要求（3）4.试点实验室如使用商品化试剂，则应当使用经过国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的试剂，临床应用前应经过性能验证；如使用自配试剂（LDT），必须建立自配试剂的标准操作程序，并经过性能评价。以上均须保存相应的实验记录。基本要求（4）5.试点实验室应对相应的检测仪器设备进行日常的维护和定期校准，并保存仪器维护校准记录。仪器设备日常维护和定期校准仪器设备是否有日维护、周（和/或月）维护、定期的零部件更换、定期校准？检查方法：1.实验室是否有上述维护和校准的SOP？☐是☐否2.是否有维护和校准的用具、试剂或用品？☐是☐否3.是否有维护、零部件更换和校准的记录（包括原始的实验室记录）？☐是☐否ABI7500校准报告ABI7500校准报告ABI7500校准报告基本要求（5）6.试点实验室应对技术人员制定培训计划，进行相关的在岗持续培训，保存人员培训记录。人员培训及能力评估人员培训的有效性？外部和内部、理论和实际操作、疾病的临床知识（临床疾病诊疗指南、治疗药物）能力评估的有效性？知识能力、操作能力、分析问题解决问题的能力、临床沟通的能力检查方法：1.人员是否有内部培训计划以及是否有内部培训？☐是☐否2.人员是否能按所制定的SOP正确的操作和维护各种仪器设备（抽查几种仪器设备及相关人员）☐是☐否3.人员的能力评估是否有程序以及能力评估方法?是否有客观的评价指标？☐是☐否基本要求（6）7.试点实验室应建立日常检测的实验记录方式，并保存相应记录。记录表格设计的标准化信息充分简单明了临床标本的检测信息能有机联系起来融入LIS系统？临床PCR检验流程记录表检验日期检验项目：扩增仪中保存文件名：使用说明：1．本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2．各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。3．本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内生物安全柜的滤膜在使用有效期内消毒溶液在有效期内冲眼器内无菌生理盐水在有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质