发酵工程复习重点

1微生物生物技术重点第一章1发酵的概念传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进行酒精发酵时产生CO2的现象。生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程。（生化）工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程2生物工程（Microbialengineering）是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。发酵工程的发展简史1、传统的发酵时期——天然发几千年酒（古埃及龙山文化）啤酒、黄酒、酱油、泡菜等特点多数产品为嫌气性发酵非纯种培养单凭经验传授技术，使产品质量不稳定（不了解微生物与发酵的关系）2、近代发酵工程时期——纯培养技术1665英国物理学家RobertHooke（罗伯特·胡克）细胞壁1680荷兰列文·虎克(AntonievanLeeuwenhoek)活细胞人类认识到微生物的存在特点多数产品为嫌气性发酵非纯种培养单凭经验传授技术，使产品质量不稳定（不了解微生物与发酵的关系）由天然发酵阶段转向纯培养发酵（第一次转折过程特点产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大3、近代发酵工程时期——深层培养技术出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志青霉素的发现与大量需求表面培养法(surfaceculture)效价40U/mL，纯度20%，收率30%二战期间，青霉素发酵生产成功青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩：开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业建立深层培养法（submergedfermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使得需氧菌的发酵生产从此走上了大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业最主要的生产方式机械搅拌通气发酵技术的建立是第二次转折4、近代发酵工程时期——代谢控制发酵技术定义：以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制的条件下培养，即能选择性地大量生产人们所需要的物2质。1956日本人Kinoshita（木下祝郎）谷氨酸发酵已用于氨基酸、核苷酸、有机酸以及一部分抗生素的发酵代谢控制发酵技术的建立是第三次转折5、近代发酵工程时期——连续化、自动化发酵技术6、近代发酵工程时期——开拓发酵原料时期7、现代发酵工程时期——现代分子生物学技术定义：应用分子生物学和分子遗传学的方法，人为的将任意生物的特定又有用的遗传基因组合到特定微生物的基因中去，在分子水平上选育新的物种，创造新的微生物，从而达到定向改变自然界微生物所不能合成的产物。（基因工程阶段）现代分子生物学技术的应用是第四次转折初级代谢产物：指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质，如氨基酸、核苷酸、脂类、有机酸、糖等，即为初级代谢产物次级代谢产物：指某些微生物在一定的生长时期（通常是稳定期），能合成一些具有特定功能的产物，而这些产物与微生物的生长繁殖无明显关系，如抗生素、色素、生物碱、胞外多糖等，即为次级代谢产物比较初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物，氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感甾体转化化学转化：步骤繁多、得率低、价格昂贵（Savett,576kg脱氧胆酸，30多步反应，两年→938mg醋酸可的松）生物法：高效、收率高（1952年，Munrry等，黑根霉，仅1步就将孕酮11位上导入一个羟基，使从孕酮合成皮质酮只需3步，这样才使可的松问世）第二章发酵工业对微生物菌种的要求1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高2、可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高3、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株4、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体5、菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性6、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全细菌、酵母菌、霉菌和放线菌细菌1、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis生芽孢、需氧菌，G+，30-39℃，pH6.7-7.2分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐生菌；生产各种酶制剂：如淀粉酶和蛋白酶32、大肠杆菌Escherichiacoli可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸的定量分析基因工程的很好材料3、乳酸杆菌(Lactobacillussp.)革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧可生产乳酸干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作6、醋酸杆菌(Acetobacter)不形成芽孢，G－，好气性分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水可生产醋酸7、棒状杆菌(Corynebacterium)以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌生产谷氨酸等9、黄单胞菌(Xanthomonas)细胞直杆状，G－，无芽孢，极生鞭毛在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物——荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素野油菜黄单胞菌(X.campestris)可以淀粉生产黄原胶(Xanthangum)放线菌链霉菌属(Streptomyces)灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)生产链霉素金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)在PDA培养基上生长时，基内菌丝产生金黄色色素生产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)产红霉素龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状生产土霉素小单胞菌属(Micromonospora)与一般放线菌不同，菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表面凸起，多崎岖，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。酵母菌啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类上面酵母——发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面下面酵母——发酵度较低，易凝集沉淀啤酒酵母的应用非常广，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母、面包制作，故又称酿酒酵母。5、假丝酵母(Candida)能形成假丝，液体培养时能形成浮膜可生产SCP、甘油、脂肪酶毕赤氏酵母(Pichia)霉菌曲霉Aspergillus米曲霉(Aspergillusoryzae)有较强的蛋白分解能力，同时又具有糖化能力；酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌；还可以用于L-乳酸的生产黑曲霉(Aspergillusniger)1具有多种强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等；42还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等3是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种产黄青霉(Penicillumchrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸橘青霉(P.citrinum):许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶微生物工程工业生产水平的三个决定要素:1生产菌种的性能2发酵和提取工艺条件3生产设备分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定富集(enrichment)培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。目的菌种的分离与筛选分离的效率取决于培养基养分、pH值和加入的选择性抑制剂通常有两种方法1涂布法将菌液梯度稀释后以灭菌的涂布器涂布于平板培养基表面。（易污染菌落，且一种菌/平板）2影印平板法把长有许多菌落的母培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的圆木柱上，然后把这一“印章”上的细菌一次接种到一系列选择培养基平板上。（不适用不长孢子的链霉菌和游动细菌）可显著提高分离筛选效率的方法有1、透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；3、生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度指示菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈4、抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如5抗生素等，便会在该菌落周围形成指示菌不能生长的抑菌圈菌种选育定义：应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然变异的方法)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是：a.为了不断提高发酵工业产品的产量和质量；b.增强对所用原辅料的适应性；c.增强对不良培养条件的抵抗；d.缩短生产周期；e.简化发酵和下游处理工艺。诱变育种就是利用物理或化学诱变剂等处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究表型迟延现象：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落的现象。（如多核）生理性延迟现象：菌体虽然发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍然不表现突变性状。如营养缺陷型凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂分为物理化学生物诱变剂（亚硝酸盐）菌种退化通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。防止菌种退化的方法控制传代次数合理的育种：单核（避免表型延迟）选用合适的培养基创造良好的培养条件采用有效的菌种保藏方法及多种保藏方法菌种的复壮在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。（广义）概念：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。（狭义）菌种复壮的方法退化菌种的复壮：稀释分离法、平板划线法、组织分离法通过寄主进行复壮：适用退化的寄生型微生物联合复壮：诱变育种菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下，使其代谢活动处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受到抑制。这样也减少了菌种的变异率。方法1真空冻干保藏2蒸馏水悬浮法3矿物油中浸没保藏4干燥载体保藏种子扩大培养指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子种子的制备过程分两个阶段：实验室种子制备、生产车间种子制备实验室种子制备1、孢子的制备：适用于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快6细菌孢子的制备：C限制，N丰富；霉菌孢子的制备：大米、小米、麸皮、麦粒等放线菌孢子的制备：含适合产孢子的物质组成，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨及无机盐等如：谷氨酸棒杆菌、青霉、龟裂链霉菌2、液体种子的制备：产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种好氧培养：如产卡那霉素的S.kanamuceticus