附录VD高效液相色谱法

附录VD高效液相色谱法髙效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。1.对仪器的一般要求和色谱条件所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。（1)色谱柱反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或髙分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm(lnm=10A)以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3～lCVm之间，粒径更小（约2pm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm：)。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过401；，为改善分离效果可适当提髙色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与珪胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用PH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用PH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八垸基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。(2)检测器最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时,一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（附录IVA)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。(3)流动相反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于c18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。对于必须使用特定脾号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。(1)色谱柱的理论板数（n)用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注人供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间&(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W)或半高峰宽（Wi/2)，按=16(«R/W)2或=5.5Uts/Wk/2y计算色谱柱的理论板数。(2)分离度0?)用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为：式中tr2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tr1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W,.W2、WZ.V2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽（如图）。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数）和分离度(K)均以峰宽(W)的计算结果为准。(3)重复性用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%;采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加人规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。(4)拖尾因子（T)用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为-除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～：I.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。'必要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。3.测定法(1)内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注人仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：定结果的影响。(2)外标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰髙），按下式计算含量由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。(3)加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载人各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载人各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主^分色谱峰的峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分〔通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD)应小于10%;含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%〕。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。(4)不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时,若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图II。色谱图I上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图n上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。(5)面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注人仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。附录硫酸盐检查法除另有规定外，取各品种项下规定供试品。供试品溶液=规定量的供试品+40ml水（溶液如显碱性，可滴加盐酸使成中性；溶液如不澄清，应滤过）→50ml比色管中+2ml稀盐摇匀对照溶液=取该品种项下规定量的标准硫酸钾溶液→50ml纳氏比色管中+水（使之约成40ml）+2ml稀盐酸摇匀于供试品溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5ml，用水稀释至50ml，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较，即得。供试品溶液如带颜色，除另有规定外，可取供试品溶液两份，分置50ml纳氏比色管中，一份中加25%氯化钡溶液5ml，摇匀，放置10分钟，如显浑浊，可反复滤过，至滤液完全澄清，再加规定量的标准硫酸钾溶液与水适量使成50ml，摇匀，放置10分钟，作为对照溶液；另一份中加25%氯化钡溶液5ml与水适量使成50ml，摇匀，放置10分钟，按上述方法与对照溶液比较，即得。标准硫酸钾溶液的制备：称取硫酸钾0.181g，置1000ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇勾，即得（每lml相当于lOOfzg的so4)。附录炽灼残渣检査法取供试品1.0~2.Og或各品种项下规定的重量，置已炽灼至恒重的坩埚（如供试品分子中含有碱金属或氟元素，则应使用铂坩埚）中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷；除另有规定外，加硫酸0.5～lml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700~800℃；炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在700～800℃炽灼至恒重，即得。如需将残渣留作重金属检查，则炽灼温度必须控制在500～600℃。