细胞生物学讲座期末复习

韩代书部分精子的发生一、精子发生的过程：精子发生是指在睾丸内精子产生的过程，精原干细胞（SSC）经过一系列的增殖与分化，产生完整精子的过程。精子发生的过程有三个阶段，即为精原细胞的增殖更新、精母细胞的成熟分裂、精子细胞变态。·有丝分裂期:精原细胞的有丝分裂·减数分裂期:精母细胞的减数分裂·形态变化期(精子形成期):精子细胞由圆形向长型的变化（一）有丝分裂期：1．精原干细胞(SSC)：SSC是精子发生的干细胞，产生的子细胞可以分为两类：一类仍保持精原干细胞自我更新能力，成为精子发生的“源泉”；另一类子代细胞则进入分化途径，形成分化过程中的精原细胞。2．DifferentiatingSPG(精原细胞)TypeAA型精原细胞的分化分为几个阶段：A1型、A2型、A3型和A4型精原细胞。Intermediate(In)SPG进行最后一次有丝分裂，形成B型精原细胞。TypeB是精原细胞的最后阶段，停止有丝分裂，分化为初级精母细胞，进入减数分裂期(meiosis)。精子发生的同步化：精子发生过程中的一个特点，许多生精细胞进行同步化分裂，并且细胞的胞质分裂不完全，导致子细胞有细胞间桥相连。这可能是它们同步分化的基础。（二）减数分裂：·第一次减数分裂：分为前期Ⅰ，中期Ⅰ，后期Ⅰ，末期Ⅰ。前期Ⅰ持续时间长，结构变化复杂，通常又可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。偶线期：两个同源染色体这时开始配对，这种配对称为联会(联会复合体)。父母DNA间发生重组。有利于物种的变异，以适应环境，保持物种的多样性，在物种的进化中具有重要意义。第一次减数分裂同源染色体分离。姐妹染色单体不分离。形成次级精母细胞。·第二次减数分裂：与有丝分裂过程基本相同，可分为前、中、后、末期。两次减数分裂间不发生DNA的合成，形成了单倍体遗传物质的精子。保持物种的遗传性，是有性生殖的基础。第二次减数分裂姐妹染色单体分离，形成单倍体细胞-----圆形精子细胞。⑴初级精母细胞(Primaryspermatocyte)前细线期、细线期、偶线期及粗线期。体积不断增大，粗线期精母细胞的体积可达到前细线期的两倍以上。第一次减数分裂后形成次级精母细胞。⑵次级精母细胞(SecondarySPC)体积比初级精母细胞小，细胞及细胞核均为圆形，细胞质较少。未经DNA的合成，进行第二次减数分裂，形成两个圆形精子细胞。⑶圆形精子细胞(Spermatid)由于在第二次减数分裂前没有进行DNA复制，所以圆形精子细胞中染色体数目减少一半，成为单倍体细胞。精子细胞不再分裂，而是进入一个复杂有序的形态演变过程，形成具有头、颈、尾结构的精子，该过程为精子形成期。（三）精子形成期：1．细胞核的变化细胞核内染色质浓缩、体积变小、偏向细胞一极，形成精子头部。染色质的浓缩主要是由于染色质中的组蛋白（histone）被富含精氨酸的鱼精蛋白（protamine）取代。这一碱性蛋白中大量的正电荷，吸引着带负电的DNA发生凝聚。2．顶体（acrosome）的形成——是由高尔基复合体形成的。精子细胞的高尔基复合体首先产生许多小液泡。小液泡融合变大，形成一个大液泡，位于核的顶部，称为顶体。内含多种水解酶，在穿卵过程中起着重要作用。3．线粒体鞘的形成——来自于细胞的线粒体。在精子形成过程中，精子细胞的线粒粒体变细伸长，迁移到中段，围绕着中央轴丝而形成螺旋状排列的线粒体鞘。物种不同，线粒体鞘构型有很大差别。而在哺乳类动物中则形成了典型的螺旋状排列的线粒体鞘。是精子运动的“能源库”。4.精子尾部的形成中央轴丝是构成鞭毛型精子尾部的基本细胞器，其外周还有致密的纤维和纤维鞘，纤维鞘并不完全到达尾的末端。包括颈部、中段、主段、末段。5.细胞质的变化精子细胞的大部分细胞质，在精子形成过程中成为残体（residualbody）而被抛弃。当细胞核前端形成顶体时，细胞质向后方移动，仅留下一薄层细胞质与质膜覆盖在和细胞核上。当尾部的后端生长时，细胞质的大部分附着在精子中段，当线粒体围绕着轴丝时，该处的细胞质和高尔基体成为残余胞质被抛弃，仅剩下一薄层细胞质包围着中段的线粒体。二、发生的主要事件：（1）二倍体精原细胞转化为单倍体精原细胞。（2）细胞核浓缩，染色质核小体中的组蛋白被富含精氨酸的精蛋白替换（3）形成顶体（4）形成鞭毛（5）线粒体缠绕中央轴丝形成线粒体鞘三、调节精子发生的因素：细胞间的调节、激素调节、基因调节（一）细胞间的调节细胞的功能：1.Sertolicell(支持与营养作用)：形成：血-睾屏障合成：雄激素结合蛋白提供：为生殖细胞提供营养分泌：睾丸液2.Leydigcell(分泌功能)：被LH激活，分泌睾酮来调节精子发生。生精细胞的不同阶段：不同成熟阶段的生殖细胞之间：包括生殖细胞与Sertolicell以及sertolicell之间，管周细胞和Leydigcell之间的联系。（二）激素的调节GnRH：促性腺激素释放激素LH：促黄体生成素FSH：促卵泡生成素ABP：雄激素结合蛋白（下丘脑—脑垂体---睾丸调节轴）1.精原细胞：FSH通过阻止凋亡来促进精原细胞的生成。睾酮对这一步基本无影响。2.精母细胞：睾酮和FSH对这一步都有影响，尤其在阻止凋亡的过程中。3.精子细胞：除去FSH和LH诱导圆形精子细胞的凋亡；除去睾酮导致圆形精子细胞和Sertoli细胞间失去粘连4.精子排放：FSH或睾酮的除去都可导致排放的精子数量减少(~15%)，当两者都撤出时，半数精子不能排放。（三）基因调节调控基因：精子发生特异基因、精子发生相关基1.特异基因三类特异基因：⑴同源基因：只在精原细胞中表达，但是与体细胞中的基因很近似。通常是一类基因家族的成员。⑵特异基因：编码精原细胞特异的蛋白，与在其他细胞中表达的蛋白有显著不同。⑶基因表达特异的转录产物：表达精原细胞特异的转录产物，与这些基因在体细胞中转录的不同。2.相关基因在Sertoli，Leydig精原细胞中表达的基因：（1）致癌基因（2）减数分裂相关基因（3）细胞周期基因（4）细胞骨架（5）温度敏感基因3.基因的表达调控基因表达的内在调控主要在三个水平上进行：转录，翻译，翻译后调控。（1）和其他细胞一样，转录水平的调控是基因表达的首要决定因素。（2）生殖细胞在翻译水平的调控比其他细胞更重要，特别是减数分裂后期的蛋白质合成。精原细胞中特定的转录调节因子：SPRM1,TAK-1,2FY-2,OCT-2,CREM翻译水平：a.选择性转录：编码不同的亚型b.mRNA结合蛋白：储存mRNAc.起始速率：与核糖体有关d.miRNA：结合到靶基因上抑制转录（3）翻译后调控主要是在精子发生过程中通过蛋白质的修饰来影响基因的转录和翻译来实现。翻译后调节：蛋白质的修饰、蛋白质的降解。蛋白质的修饰：甲基化/去甲基化，乙酰化/去乙酰化，磷酸化/去磷酸化。可以改变染色质的结构，调节基因转录活性。激活蛋白激酶，传递信号；激活转录因子，调节基因表达。a.泛素化途径：泛素由76个aa的多肽链，泛素被泛素连接酶转移并结合于底物蛋白质，底物被泛素化，泛素化的蛋白质迅速降解。b.自噬途径:细胞内需要降解的成分(包括老化的细胞器及多余的蛋白)被溶酶体吞噬并降解。精子发生的过程：是一个特殊的细胞分化过程原始的生精细胞——精原细胞——精母细胞——圆形精子细胞——长形精子细胞精子发生过程中主要的事件：双倍的精原细胞转化成单倍的精子细胞核浓缩，染色体核小体的组蛋白被鱼精蛋白代替顶体的形成鞭毛的形成线粒体缠绕中央轴丝形成线粒体鞘研究基因表达的方法：RT-PCR、NorthernBlot、RNase保护实验.基因芯片：同时可分析大量的基因表达四、基因表达谱：⑴基因的特异性表达①我们体内大多细胞含有相同基因②并不是所有基因在每一个细胞都表达③当需要时一些基因才表达④许多基因表达为某一类细胞所特有（如肝细胞表达解毒酶，胰细胞表达胰岛素）⑤为了了解细胞是如何产生表达特异性的，要确定每类细胞的所表达的基因⑵研究基因表达的方法RT-PCR、NorthernBlot、RNase保护实验、基因芯片（同时可分析大量的基因表达）⑶现在的研究状况：运用微阵列技术来确定基因控制的精子发生。膜芯片及玻璃芯片的特点：a.膜芯片：DNA结合牢固、点样量大、同位素标记（灵敏度高）、可重复使用、可自己分析，结果可靠，便宜，基因点数少。b.玻璃芯片：两组样品可在同一张芯片上杂交、基因点多，需特殊设备，由服务公司完成，可靠性较差，昂贵五、生殖细胞：1.是生命周期的一个关键环节。2.发生减数分裂，形成单倍体细胞，保证了物种的遗传性。3.DNA发生重组，后代产生变异，保持物种的多样性。4.卵是机体最大的细胞，携带充足的原料。5.精子通常最小，利用母本资源扩增父本基因，形体流线，运动能力较强，适应受精。基因转移与RNA干扰一、基因转移（genetransfer）㈠基因转移是通过不同途径把外源基因转移到宿主细胞中，并在细胞中表达的过程。其目的是研究基因的表达调控及其功能。包括转染、转化、感染。转染：把外源基因转移到真核细胞中，主要指哺乳动物细胞。转化：把外源基因转移到原核细胞中的过程，指细菌中。感染：用病毒做载体进行的基因转移。㈡基因转移两个主要因素：受体细胞：接受外源基因的细胞。基因载体（运输工具）：携带目的基因并运送至细胞内。□受体细胞应满足以下条件：1.细胞本身并不表达要转染的基因，否则无法区分内源和外源基因。2.基因的细胞特异性表达：一些基因需要合适的细胞系才能表达，它们可以在一些细胞中被诱导表达，在另一些细胞中不能被诱导表达。3.选择容易被转染的细胞：容易培养、生长速度快的细胞容易被转染,成纤维细胞比上皮细胞容易被转染。4.两种常用细胞系：COS细胞:用SV-40基因组转化猴的CV-1细胞CHO细胞:中国地鼠卵巢的成纤维细胞□基因载体：·载体的功能：1.为了外源基因的表达：克隆的基因多数为cDNA，缺乏表达所必需的调控元件,需要重组到带有这些调控元件的载体上才能有效的表达。2.为了更有效的进入细胞：载体容易进入细胞。·理想的载体：（1）可以高水平的表达目的基因（2）可以高效的转移到细胞内（3）具有高度的安全性（特别是基因治疗）·载体可以分为两大类：病毒载体(viralvector)；非病毒载体(non-viralvector)1、非病毒载体--质粒，是环状双链DNA，具有酶切位点，可分为：a.非表达载体(克隆载体):不含有表达元件,只用于基因的保存、扩增、序列分析b.表达载体:含有表达元件，分为真核细胞表达载体和原核细胞表达载体质粒优点：（1）安全性比较高，（2）可整合到宿主基因组中，稳定表达。缺点：（1）转染效率低，50%（2）随机整合，可能干扰宿主的基因。2、病毒载体：由于病毒的结构和生物学特性，如感染细胞、可把外源基因重组到病毒内，通过感染细胞把外源基因转到细胞内。可分为逆转录病毒（RNA病毒）、腺病毒（DNA病毒）、腺相关病毒。1)逆转录病毒：优点：（1）感染效率高，有时可高达100%（2）可整合到宿主基因组中，稳定表达。缺点：（1）只感染并整合到分裂细胞（2）随机整合，可能干扰宿主的基因，从而引起疾病。2)腺病毒：（1）可以携带大量的外源基因，感染及表达效率高。（2）基因不整合到属主细胞的基因组中，不会引起疾病，但只能瞬间表达。（3）易受免疫系统的攻击。3)腺相关病毒：感染效率高；携带的基因较少（4.5kb)；可以整合到基因组中。㈢基因转移的方法：以质粒为载体的基因转移方法：1.DNA-磷酸钙沉淀法：Ca2+、PO4-和DNA形成沉淀颗粒，可以沉附于细胞的表面，通过内吞作用摄取DNA。适用于贴壁和悬浮培养的细胞。转染效率低，小于10%。影响转染效率的因素：（1）沉淀颗粒的大小，由PH（7.05）控制（2）沉淀中DNA的量，需高纯度的DNA（10-50g）（3）沉淀处理细胞的时间，6-24hr，因细胞不同而异2.脂质体介导的基因转移：原理：脂质体+DNA→复合体，DNA被包围在复合体内，通过与细胞的融合或内吞进入细胞。特点:(1)转染效率高，可大于50%(2)操作简便