第一章脱落细胞检查技术和临床应用评价

第一章脱落细胞检查技术和临床应用评价脱落细胞学：是对人体各部位特别是管腔器官表面的脱落细胞，或对病变组织通过细针吸取的方法获得的细胞染色并在显微镜下观察作出诊断，又称诊断细胞学。标本来源：自然排出物体腔抽出液细针穿刺吸取液第一节标本采集和涂片制作一、标本采集原则：尽量减少受检者的痛苦，取得合作；方法简便、实用、经济；尽量取得足够供诊断的细胞成分；及时快速送检立刻制片；绝对避免污染；标本号标记清楚。途径：细针穿刺；脱落细胞学检查常用方法直视采集法：直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗自然分泌液采取法：痰涂片、尿液涂片、前列腺液涂片、乳头溢液涂片灌洗法：空腔器官、盆腔或腹腔摩擦法：鼻咽、食管、胃针穿抽吸法：浆膜腔关节腔积液，淋巴结、软组织、甲状腺、肝浆膜腔积液的处理抽出应立即送检（4℃保存，24h内处理完标本）对检查影响较大的是过多成熟的红细胞和标本的严重凝固，需处理，淋巴细胞分离液或低渗方法可去除红细胞，凝固的积液将凝块吸出，剩余液体离心涂片。二、涂片制作（一）要求：1标本要新鲜2操作要轻柔：细胞分布均匀；薄厚适当勿挤压摩擦，以免细胞损伤变形；3玻片要清洁4涂片要牢固5涂片数量6标号准确（二）涂片制备方法推片法涂抹法压拉涂片法吸管推片法喷射法印片法（三）涂片的固定目的：保持细胞形态结构，防止其自溶。固定液：首选95％酒精，乙醇乙醚，氯仿乙醇注意事项：巴氏染色，涂片勿在空气中干燥后染色；固定时间不短于15分钟（48h内进行巴氏染色）；固定液要达到90％以上；液体标本离心后涂片，待潮干后再固定，宫颈的刮片、痰涂片、拉网涂片、内窥镜的刷片、针吸涂片应立即固定。干燥固定固定时间：15～30min固定方法：带湿固定（四）涂片的染色目的：使细胞结构清晰显示；应用各种染色使细胞浆与核恰当显示不同颜色；使细胞透明度高，结构清晰。方法：常规染色为巴氏染色，配合HE、Giemsa、特染等。1巴氏染色法•水化：固定好的涂片→80％、70％、50％乙醇→蒸馏水各1min•染核：苏木素染3～5min•分色：1％盐酸中数秒，水洗•蓝化：置饱和碳酸锂溶液中1min，水洗•脱水：50％、70％、80％、95％乙醇各1min•染浆：置于橘黄G液中染2～4min→95％乙醇洗2次→置于EA36染液中4～5min•脱水：95％、无水乙醇各1～2min→二甲苯透明2～3min×2•封片：中性树胶封固••适用于上皮细胞染色和阴道涂片观察女性激素的影响•优点：细胞具有多色性•缺点：染色程序较复杂•结果判定：胞核呈紫蓝色，核仁红色，底层细胞、中层细胞和表层角化前细胞为淡蓝色，不全角化细胞（角化前细胞）呈粉红色，角化细胞呈桔黄色。注意事项：染液要充分溶解苏木素要染前月余配制，用时每天过滤1次，加新液。室温低时不易着色，可50℃加热盐酸分化前镜下观察以确定分化时间涂片在橘黄液中不宜过长EA36染液配制和使用前应用滤纸调试2HE染色：透明度好、核浆对比鲜明、染色效果稳定，核紫蓝色、浆淡玫瑰红色。步骤简单，适用于痰涂片。3瑞氏－吉姆萨染色：多用于血液、骨髓细胞学检查常规巴氏制片与液基薄层制片比较巴氏液基薄层制片10～20％标本移至玻片100％标本收集至保存液中干固定湿固定制片技术不稳定，不能重复技术稳定，可重复易受血黏液炎性渗出物覆盖去除血黏液和大量炎性遮盖物细胞分布不均匀，易重叠细胞分布均匀集中，不易重叠镜下观察费力，易漏诊镜下观察省力，不易漏诊成本较低成本较高染色一、瑞特染色法(Wright's)特点:固定和染色合并在一起,手续简便,染色时间短,对白细胞特异性颗粒着色较好,但对核的着色差.1.瑞氏染料:由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝(M+)为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝,其有色部分为阳离子，无色部分为阴离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红(E-)通常为钠盐,既伊红化钠有色部分为阴离子，无色部分为阳离子，其有色部分为酸性。伊红和亚甲蓝混合后，产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀(ME)，即瑞特染料(其溶于甲醇即瑞特染液)。ME（瑞氏染料）————→M++E-2.甲醇的作用:用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：（1）溶解:甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。ME（瑞氏染料）————→M++E-在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。（2）固定,升温:甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应3染色原理细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。⑴.血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染红色，称为嗜酸性物质；⑵细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性蛋白质，与碱性染料美蓝或天青结合，染蓝色，称为嗜碱性物质；⑶中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为中性物质。4.影响因素:⑴PH对细胞染色影响:细胞各种成分均为不同蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞特液必须用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。⑵空气氧化作用:新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。⑶挥发:瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，并可使细胞染色清晰。甲醇必须纯净(AR级)，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。5.瑞氏染液配制：(1)瑞氏染液Ⅰ液：瑞氏染料830mg或1g甲醇（AR）500ml或600ml甘油15ml先将干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末声，加少许甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用装过甲醇的空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，用甘油密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。(2)瑞特染液Ⅱ液缓冲液：1)缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，pH一般在6.4~6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。2)缓冲液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：配方1：配方2：KH2PO4—0.3gNa2HPO4—0.2g(1%磷酸二氢钾30ml加1%磷酸氢二钠20ml)H2O(新鲜)加至1000ml置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。6.染色:a.取已干燥的血涂片，用蜡笔在血膜两端划线b.将血涂片放平(置于染色架上)，用滴管滴染液3－5滴于片上，并用滴管或吸球将染液驱散，使其布满整个血膜，放置约30秒钟。c.加入等量缓冲液，用吸球轻轻吹动，使染液与缓冲液充分混匀，放置染色约5－10分钟。d.然后用细小流水自片端冲去染液，切勿先倾去染液再用水冲。e.血片自然干燥后即可镜检。第二节显微镜检查一、阅片要求：核对送检单与涂片的编号；了解病史及临床情况与送检目的；涂片应封固；先低倍镜逐个视野仔细阅片每个视野部分重叠，以免遗漏；找到具有诊断意义或值得讨论的细胞，要作标记。观察项目：涂片中的细胞成分；细胞的排列方式；一群细胞的毗邻关系；单个细胞的特征；核浆比例；细胞的退变情况；涂片背景中细胞成分和非细胞成分。诊断回报方式分级诊断法和描述性诊断法。Ⅰ级：为见异常细胞Ⅱ级：细胞有异型性但无恶性特征Ⅲ级：疑为恶性但证据不足Ⅳ级：高度提示恶性改良巴氏五级分类法：Ⅴ级：肯定恶性细胞学诊断的质量管理体系标本采集制片过程阅片诊断理论学习复查会诊定期随访第三节脱落细胞学检查的临床应用评价优势：安全简便、快速准确、检查范围大细胞诊断学的应用范畴（一）防癌普查（二）肿瘤治疗后随访观察（三）癌前病变的追踪观察（四）作为某种治疗手段的监测指标（五）估计卵巢功能，指导内分泌治疗细胞诊断学的应用价值（一）对初筛恶性肿瘤具有重要意义（二）可发现早期癌，做到早期诊断（三）具有广泛应用的基础（四）对难于取得组织学诊断材料时，细胞学诊断可弥补形态学诊断的空白。细胞学诊断的局限性和片面性的原因：（一）取材不佳（二）制片质量欠佳（三）病变的情况：肿块大小、肿物的性质、肿瘤分化程度、肿瘤的组织类型、肿瘤的早晚、肿瘤与周围组织关系等。不足：1有一定误诊率：细针穿刺10％假阴性，痰涂片20％的假阴性2具体部位难确定3肿瘤分型困难4非肿瘤性疾病诊断研究少细胞诊断学与病理诊断的关系：细胞学诊断准确性低于病理组织学诊断，因此细胞学诊断有赖于病理组织学诊断的证实。辅助检查：组织化学免疫组化流式细胞仪DNA分析染色体倍体分析电镜第二章脱落细胞检查的基本知识第一节细胞诊断学的基本概念一、细胞增生活跃细胞体积增大，核明显增大，核染色质增多，颗粒增粗，核仁增大增多，核浆比例失常，胞浆蓝染（巴氏），可伴核分裂像。二、组织修复细胞组织损伤或修复过程中从新生上皮脱落下来的细胞特征：细胞多成片出现，似合体细胞，排列规则；细胞稍增大，胞核也增大，核不深染，胞浆尚丰富，深染；核仁明显增大或增多；可能出现核分裂像。三、细胞化生1未成熟的鳞状上皮化生细胞的特征：似正常上皮外底层细胞大小；多成群出现，可呈铺砖式排列；细胞呈圆或卵圆形，边缘有小突起；胞浆常有小空泡使胞浆透亮。2成熟的鳞状上皮化生细胞的特征：细胞似正常鳞状上皮中层细胞大小；多成群出现，细胞呈多边形，有锐角突起，形态多样；胞浆中常见小空泡。胞浆少，排列紧密，无细胞间桥。四、储备细胞增生储备细胞是柱状上皮细胞下的一层具有分化潜能的幼稚细胞（或未分化细胞）。形态特征：细胞小，似鳞状上皮内底层细胞大小；圆或卵圆形，胞浆有小突起；胞浆淡染可见小空泡；核偏位，可能大小稍不一致；核染色质匀细，可见核仁和几个大小一致的核粒：细胞常成群，有时彼此相连；其周围常伴化生细胞。五、细胞增生细胞分裂增强，数目增多，体积可增大，形态可出现异常。细胞大，核大，核染色质增多、增粗，双核或多核，核仁明显，核膜增厚，甚至轻度不规则。可分为轻度和重度增生。六、细胞分化从幼稚细胞发育成具有完备结构和功能的成熟细胞的过程。上皮细胞分化的形态表现：1细胞体积由小到大2胞浆量由少到多3核浆比由大到小4饱和由大到小5染色质排列由疏松到致密6核仁由大到小，由多到少七、细胞核分裂像病理性分裂像应与核碎裂鉴别（核染色质呈大小不等的块状）八、细胞退行性变细胞退变包括变性和坏死，涂片中二者鉴别较困难，统称退变。1人工引起的退变原因：标本放置过久，细胞自溶；细胞置于高渗或低渗溶液中；固定液浓度或时间不适合，过湿或过干形态特征：细胞呈大片结构不清，细胞均增大或均缩小，胞浆多呈红染，各种类型细胞退变形式一致。2细胞自然退变原因：细胞脱落过久，细胞营养不良，炎症、放疗、化疗的影响，肿瘤表面供血不足，细胞生理性衰老类型：（1）肿胀性退变－－细胞及胞核肿大，染色质模糊、断裂并淡染，核内有空泡。胞浆空泡状、蜂窝状或网孔状，胞界不清胞膜消失。（2）固缩性退变－－细胞及胞核缩小，胞浆红染、橘黄