特异性抗体制备技术

免疫原和抗血清制备技术第一节免疫原的制备第二节免疫血清的制备第三节抗体的纯化和鉴定第一节免疫原的制备一、细胞性抗原的制备二、可溶性抗原制备及鉴定三、半抗原免疫原的制备四、佐剂绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无菌试验O菌体抗原返回•来源:组织和细胞，其成分比较复杂。1.组织和细胞成分混合抗原制备2.蛋白质抗原制备3.核酸抗原制备4.类脂多糖抗原制备5.免疫球蛋白片段制备6.纯化抗原的鉴定•可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸返回组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心细胞破碎技术及评价1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理•常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等1.酶处理法•方法：在一定的条件下，能消化细菌和•组织细胞。•特点：①此法适用多种微生物；•②具有作用条件温和；•③内含物成分不易受到破坏；•④细胞壁损坏的程度可以控制。2.冻融法•原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。•方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。•特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。•原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。•常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。•应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取核酸时，常用此法破碎细胞。4.表面活性剂处理蛋白质抗原制备•蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的抗血清通常需要纯化。可采用：1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法1．超速离心法•原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。•特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。•应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。•原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。•常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。•特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。•应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。•原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，•经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种•分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分•子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝•胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时•间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝•胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分•成大、中、小三种类型。4．离子交换层析法•原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。5．亲和层析法（亲和色谱）•原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。•优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。正常细胞＋标记细胞洗滴标记细胞被酶裂解加入特异性抗体其它蛋白洗涤流失SDS-PAGE分离蛋白亲和层析法示意图核酸抗原制备•大分子的核酸具有免疫原性。•提取核酸的主要步骤：破碎细胞核酸从细胞中游离出来酸沉淀核除去蛋白质乙醇酚和氯仿•苯酚法提取LPS：干燥菌体或湿菌体水中混匀激烈搅匀加热5min冰水急冷降至10℃以下离心上层的水层(含LPS)下层的酚层菌体残渣于底部吸取水层透析除酚加热超速离心浓缩LPS在上层沉淀的透明胶状部内绞出悬于水中离心得纯化LPS同温的苯酚1．酶裂解法酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解为不同的片段。2．氧化法和还原法是将免疫球蛋白轻、重链分开的两种常用方法。3.还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋白亚单位分开。酶水解免疫球蛋白示意图Fc段，用以制备抗重链血清F(ab’)2，常作为抗体试剂用于试验1.氧化法：优点是切开后，肽链不能重新形成二硫键、便于肽链纯化；缺点是色氨酸侧链容易被破坏。氧化法和还原法评价返回2.还原法：将二硫键还原成琉基。但极不稳定，易重新形成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。纯化抗原的鉴定1.含量鉴定2.理化性质鉴定①凝胶层析技术测定②聚丙烯酰胺凝胶电泳③凝胶管状电泳④超速离心3.纯度鉴定常用醋酸纤维膜电泳4.免疫活性鉴定常用双向琼脂扩散试验蓝色1．含量鉴定在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。•方法：酚试剂法鉴定•主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸•原理：蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能钨酸、钼酸还原3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20络合物的双缩脲法蛋白质＋Ca2+碱性加深蓝色已知分子量的标准品•测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。•此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱保留体积分子量的对数2.理化性质鉴定绘制标准曲线①凝胶层析技术进行测定垂直电泳聚合成大分子凝胶②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）•有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精确地分离和鉴定高分子物质。•PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。•原理：双丙烯酰胺N,N-methylenebisacrylamide,Bis丙烯酰胺(acrylamide,Acr)催化剂3.纯度鉴定•方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。返回•原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此所带电量也各不相同，在外加直流电场的作用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白质抗原的纯度。•特点：快速简便。三、半抗原免疫原的制备1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。2.载体：蛋白质类多肽聚合物大分子聚合物3.半抗原-载体连接方法:载体类型1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋载体蛋白质搅拌1～2h室温24h透吸除去未反应的半抗原人工免疫原混合混合半抗原-载体连接方法2戊二醛法:半抗原-NH2载体蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂半抗原-载体连接方法3氯甲酸异丁脂法：半抗原-COOH载体蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-载体蛋白简便，用于类固醇抗原制备HO-CH2CH(CH3)2＋半抗原-载体连接方法4琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原-CH2OHCH2-COCH2-CO带羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH返回吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原四、佐剂*概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。条件：①增加抗原的表面积；②改变抗原的活性基团构型；③佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间；④可直接或间接激活免疫活性细胞；⑤无毒性或无副作用。（二）常用佐剂的种类和制备1.氢氧化铝佐剂：5%硫酸铝5%氢氧化钠氢氧化铝沉淀制成悬液即为佐剂强烈搅拌NS洗二次NS等体积抗原免疫接种2.明矾佐剂10%硫酸钾铝氢氧化钠校正pH值至6.5沉淀乳状悬液*明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽种和脓肿。NS搅拌NS洗二次离心抗原备用防腐剂•作用大于不完全佐剂•局部形成肉芽种和溃疡•不能用于人体弗氏完全佐剂3.弗氏佐剂(Freundadjuvant)液体石蜡完全乳化备用＋高压灭菌加热抗原弗氏不完全佐剂卡介苗羊毛脂鉴定一滴乳剂乳剂不散浮于液面水中混合4.佐剂应用原则和评价目的:①增强抗原对机体的免疫原性；②增强抗体的产生能力；③为制备出高效价的免疫血清；④增强可溶性抗原的免疫原性；⑤在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；⑥延长抗原在免疫动物的时间；⑦改变抗原的分布；⑧增强局部对变应原的超敏反情况；应用佐剂的缺点①佐剂常混有微量其它物质，这些物质进入体内后也可引起抗体的产主，影响抗血清的特异性；②注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌性脓肿；③反复注射，易发生超敏反应，使局部组织坏死，甚至引起动物死亡。第二节免疫血清的制备1.免疫动物选择2.免疫方法3.动物采血法4.免疫血清的分离及保存一、免疫动物选择•能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、体重合乎要求；3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；4.按需要量选择大小不同的动物。二、免疫方法3.免疫方案①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射②微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月抗原③混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉1.免疫原的注射剂量2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌三、动物采血法1.颈动脉放血法：最常用的方法2.心脏采血法：要求操作熟练3.静脉采血法：1.4℃保存：可保存3～6个月2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年3.冰冻干燥保存：可保存3～5年四、免疫血清的分离保存第三节抗体的纯化和鉴定1.抗体特异性的纯化2.特异性IgG类抗体的纯化3.特异性抗体的鉴定一、抗体特异性的纯化1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。二、特异性IgG类抗体的纯化1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取γ球蛋白3次，基本为IgG类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：凝胶