王镜岩第15章核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定五、DNA聚合酶链反应（PCR）六、DNA的化学合成一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。（一）DNA分离真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀。（二）RNA的分离RNase的灭活：玻璃器皿：140-200℃，8h塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂★用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法（三）核酸含量的测定方法核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260nm和280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。①磷的测定RNA中含磷量为9.0％，DNA中含磷量为9.2％，因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。②核糖和脱氧核糖的测定RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质，在670nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在595nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。③紫外吸收的测定实验室中最常用的是首先测定样品在260nm和280nm的光吸收值（A值），从A260／A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA（或RNA）或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。二、核酸的超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。（一）核酸密度的测定8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部）平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离（二）测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系ρ=0.100xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。（三）溶液中核酸构象的研究浮力密度：RNA＞DNA变性DNA＞双链DNA＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大超螺旋DNA或三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖电泳影响迁移率的因素：①核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢④电流，不大于5V/cm染色：0.5μg/mlEB（溴化乙锭）RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定琼脂糖电泳还可以用于DNA的制备与纯化（二）PAGE电泳用于小片段DNA的分析，精度非常高四、核酸的核苷酸序列测定（一）双脱氧终止法英国Sanger1955确定牛胰岛素结构，1958获诺贝尔化学奖1975设计出DNA测序法，1980获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。双脱氧核苷酸测序法（MOV）DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）化学裂解法Maxam-Gilbert，1977原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACGG反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸/哌啶C反应：肼/NaCl/哌啶C+T：肼/哌啶哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P*ACTTCGACAG（三）RNA的测序（1）酶裂解法胰RNaseA：嘧啶结尾米曲霉RNaseT1：鸟苷酸结尾黑粉菌RNaseU2：腺苷酸结尾多头黏菌RNasePhyI：A、G、U结尾（2）化学裂解法（3）逆转录成cDNA法五、DNA聚合酶链式反应（PCR）①模板DNA（单链）②引物③DNA聚合酶（Taq）④dNTP⑤Mg2+PCR（MOV）六、DNA的化学合成固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3′→5′端5′-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3′-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护