熏肉制品中亚硝酸盐的检测(分光光度法)

-1-2011-2012仪器分析综合设计性实验报告熏肉制品中亚硝酸盐的含量测定-2-熏肉制品中亚硝酸盐的含量测定【摘要】亚硝酸和硝酸的钠盐和钾盐常被加入用于腌肉的混合物中，用来产生和保持色泽、抑制微生物和产生特殊的风味。此外，亚硝酸盐（150-200mg/kg）可抑制罐装碎肉和腌肉中的梭状芽孢杆菌。本实验就是利用紫外分光光度法对熏肉制品中的亚硝酸盐进行定量测定。本实验法对亚硝酸盐有很好的选择性，测量的灵敏度高。【关键词】紫外分光光度法，熏肉制品，亚硝酸盐含量【引言】分光光度法同时测定多组分体系具有不需进行化学分离和引入过多试剂以及操作简便等优点而日益受到关注，用各种化学计量学方法和借助导数输出等方式解析重叠光谱是目前发展最快的领域之一。用光度法测定肉制品中硝酸根及亚硝酸根，文献报道的有：紫外检测－离子色谱法、标准加入—偏最小二乘导数分光光度法、一阶导数分光光度法、比光谱导数法等。-3-【实验部分】一、方法原理：（α-萘胺法）自样品中抽提分离出亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比，可比色测定。反应式如下：NH2SO3HN+NSO3HNO2-H+OH2+++NSO3HNNH2N+NSO3H+NH2肉制品中亚硝酸盐含量==50150020100010001mX（mg/kg）式中：X为由测得的吸光度什在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。也就是样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，用分光光度计测量含量。二、主要试剂及仪器（1）亚铁氰化钾溶液：称取10.6克亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水，并稀释至100mL。（2）乙酸锌溶液：称取22.0克乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。（3）饱和硼砂溶液：5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100mL热水中，冷却备用。-4-（4）0.4%对氨基苯磺酸溶液（4g/L）。（5）0.2%α-萘胺溶液(2g/L)。（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：精确称取0.1000克于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500mL。（7）亚硝酸钠标溶液（5μg/mL）：临用前，吸取此溶液25mL，用水定容到1000mL。（8）仪器：①研钵，②分光光度计，③分析天平，④2mL、5mL、10mL移液管各2支，⑤漏斗1个，⑥25mL容量瓶1个，⑦500mL容量瓶2个，⑧50mL容量瓶12支，⑨滤纸若干。三、实验操作(1)样品处理样品中硝酸盐及亚硝酸盐的提取：称取经搅拌混合均匀的样品5克于50mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅拌，然后用70℃左右的水约300mL，将其稀释转移到500mL容量瓶，沸水浴中加热15分钟，取出，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。冷却到室温，用水定容，摇匀。放置片刻，去除上层脂肪，清液用滤纸过滤。(2)最大吸收峰的波长的确认——α-萘胺—亚硝酸钠吸收曲线的绘制用移液管吸取亚硝酸钠标准溶液(5μg/mL)1.0mL(含5μg亚硝酸钠)于50mL容量瓶中，加水至25mL，分别加2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入1mL0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。静置15min后，用20mm比色皿，用分光光度计在450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm，520nm，530nm，535nm，540nm，545nm，550nm，555nm，560nm，570nm，580nm，590nm，600nm，610nm波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制α-萘胺—亚硝酸钠吸收曲线，找出最大吸收峰的波长。(3)显色剂α-萘胺溶液最佳用量的确定用移液管精确吸取四份亚硝酸钠标准液(5μg/mL)1.0mL(含5μg亚硝酸钠)分别于50mL容量瓶中，各加水至25mL，各加2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，分别加入0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL-5-0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。静置15min后，用20mm比色皿，用分光光度计在最大吸收峰的波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。记录每个用量对应的吸光度，找出最大吸光度所对应的α-萘胺溶液用量。(4)获得最大吸光度的最佳显色时间的确定用移液管吸取亚硝酸钠标准溶液(5μg/mL)1.0mL(含5μg亚硝酸钠)于50mL容量瓶中，加水至25mL，分别加2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入最佳用量的0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。分别静置5min，10min，15min，20min后，用20mm比色皿，用分光光度计在最大吸收峰的波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。记录每个时间所对应的吸光度，找出最大吸光度所对应的显色时间。(5)亚硝酸钠标准曲线的绘制用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液(5μg/mL)0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL(各含0，1，2，3，4，5，7.5，10μg亚硝酸钠)于一组50mL容量瓶中，各加水至25mL，分别加2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入最佳用量的0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。静置15min后，用20mm比色皿，用分光光度计在最大吸收峰的波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。比色液中亚硝酸钠浓度为0～0.30μg/mL时，两者呈线性关系。本法的标准偏差为±3.0%。(6)亚硝酸盐的测定另取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。静置3～5分钟后，加入二分之一最佳用量的0.2%α-萘胺溶液，比色测定，记录吸光度。根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μg/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。-6-四、实验结果1.最大吸收峰的波长的确认——α-萘胺—亚硝酸钠吸收曲线的绘制记录不同波长对应的吸光度，并绘制吸收曲线。波长与吸光度对应数据见表1—1吸收曲线见图1—1波长/λ450460470480490500510520530535吸光度A0.0040.0080.0140.0230.0350.0480.0630.0780.0860.088波长/λ540545550555560570580590600610吸光度A0.0910.0920.0890.0850.0800.0660.0480.0220.0070.001（表1—1）00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1440460480500520540560580600620α萘胺——亚硝酸钠吸收曲线波长/λ吸光度/A吸光度A（图1—1）-7-2.显色剂α-萘胺溶液最佳用量的确定α-萘胺溶液用量与吸光度关系见表1—2α-萘胺溶液用量0.5mL1.0mL1.5mL2.0mL吸光度A0.0720.0730.0710.071（表1—2）由以上数据可知，α-萘胺溶液最佳用量为1.0mL。3.获得最大吸光度的最佳显色时间的确定最大吸光度与显色时间关系见表1—3显色时间5min10min15min20min吸光度A0.0710.0750.0740.071（表1—3）由以上数据可知，获得最大吸光度的最佳显色时间为10min。4.亚硝酸钠标准曲线的绘制亚硝酸钠标准液用量与吸光度关系，数据见表1—4亚硝酸钠标准液用量与吸光度关系，吸收曲线见图1—2亚硝酸钠标准液用量（mL)0.000.200.400.600.801.001.502.00吸光度A0.0000.0130.0270.0450.0570.0720.1050.144（表1—4）00.050.10.150.200.511.522.5亚硝酸钠标准曲线y=0.0717x-0.0004R^2=0.9991亚硝酸钠标准液用量/mL吸光度/A吸光度A线性(吸光度A)（图1—2）因此，标准曲线的线性回归方程为y=0.0717x-0.0004-8-g15.220mL25mLg/mL534.0mL5.亚硝酸盐的测定20mL待测液于25mL容量瓶吸光度A0.024把0.024代入y，则x=0.34mL，则待测液（1）中亚硝酸钠含量为可见肉制品中亚硝酸盐含量（mg/kg）为11.29mg/kg。五、实验结论可见肉制品中亚硝酸盐含量（mg/kg）为11.29mg/kg。根据国家标准肉制品中亚硝酸盐残余量均应≤30mg/kg，可知受监测的熏肉符合标准。六、分析与讨论1、亚硝酸盐在肉制品中的作用以及使用规范亚硝酸盐是国家允许限量使用的食品添加剂。肉制品中亚硝酸盐主要来源为食品添加剂亚硝酸钠，其在食品加工行业中主要起保色和防腐作用。亚硝酸盐可与肉品中的肌红素结合而更稳定，所以常被添加在香肠和腊肉中，使肉品鲜红，维持良好外观。亚硝酸盐能够有效地抑制肉毒芽孢梭菌(Clostridiumbotulinum)的生长，而后者产生的肉毒毒素是已知最剧烈的神经外毒素，对人致死量为0.1ug。此外亚硝酸盐对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)等多种微生物有抑菌效果，因此有防腐作用。亚硝酸盐对人的致死量为22毫克每公斤体重。在烹调或其他条件下，肉品内的亚硝酸盐可与氨基酸降解反应，生成有强致癌性的亚硝胺。根据GB2760-2007国家食品添加剂使用卫生标准，在腌腊肉制品类、酱卤肉制品类、熏烧烤肉类、油炸肉类、西式火腿类、肉灌肠类、发酵肉制品类、肉罐头等各类熟肉制品的生产过程中，亚硝酸盐的最大使用量均为0.15g/kg，以亚硝-9-酸钠计，残留量除西式火腿类应≤70mg/kg，肉罐头类应≤50mg/kg外，其余品类肉制品中残余量均应≤30mg/kg。2、实验讨论本实验是多人大组，两人小组完成实验，可以避免试剂的浪费，但是也减少了我们实际操作的机会，比如我们平时较少接触到的蛋白质的沉降，以及浑浊液的冷却过滤，在本实验中也只是一个小组有机会操作。而对于分光光度计的使用，因为已经是第二次所以并不构成什么问题。但是有的仪器不太敏感，需要维护。【参考文献】［1］王春林,于炎湖,齐德生.饲料与食品中亚硝酸盐的危险和预防［J］.饲料研究,2000,(10):22—25.［2］ShanthiK,BalasnbramanianN.TheSpectrofluorometricMethodforDeterminingTraceSeleniuminFodder［J］.J.AOACInt.,1994,77(6):1639.［3］高艳阳,徐春彦.催化分光光度法测定痕量亚硝酸根［J］.华北工学院学报,1997,18(2):133.［4］AhmedMJ,StalkasCD,CannonHL.RapidDiagnosticMethodforGoatsNitriteIntoxicationtheDetectionofUrineorSallivausingACottonProbewithNitrideReagent［J］.Talanta,1996,43(7):1009.［5］杨景和,邹华彬,任学贞等.荧光光度法测定天然水中痕量NO-2和NO-3［J］.理化检验(化学分册),1993,29(5):278.［6］王洪艳.计算机与化学化工实验数据处理［M］.长春:吉林大学出版社,2002.148.［7］中华人民共和国国家标准《GB2760-2007食品添加剂使用卫生标准》