德国鸢尾的组织培养

植物组织培养实验设计方案实验组别:12级生物技术班B组组员:董发明雷艳萍张金菊陈冬梅薛勰德国鸢尾的组织培养一、实验目的与实验要求1.学习植物组织培养的配制方法与保存方法。2.掌握无菌操作的植物组织培养方法。3.通过诱导德国鸢尾茎尖形成不定芽，进而诱导生成不定根，培养出新植株，学习植物组织培养技术。4.了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程，加深对植物细胞全能性的理解。5.认识植物组织培养技术在生产实践中起的作用，尤其在保存珍贵物种和生产研究方面的应用。二、实验原理德国鸢尾（拉丁名IrisgermanicaL.目:百合目科:鸢尾科属:鸢尾属种:德国鸢尾）。德国鸢尾品种系列可用作切花和盆栽,该品系既可观花又可观叶,在华东地区四季常绿,是难得的庭园绿化材料。在我国,目前优良的德国鸢尾品种数量很少,它在庭园绿化上的应用几乎是空白,因此,通过组织培养快速繁殖是目前尽快满足应用需求的唯一有效途径。本实验的结果可为德国鸢尾种苗的工厂化生产提供一定的依据。三、实验器材冰箱，分析天平，烧杯（50mL，100mL，500mL，1000mL），量筒(1000mL，100mL，25mL)，容量瓶(1000mL，500mL，100mL)，磨口试剂瓶(500mL，1000mL)，药勺、称量纸、精密pH试纸，滴管、玻璃棒、电炉，微波炉、移液管（10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL），吸耳球，滴瓶，锥形瓶、纱布，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，标签纸，记号笔、解剖工具、托盘、棉花、超净工作台四、实验药品NH4NO3,KNO3,CaCl2•2H2O,MgSO4•7H2O,KH2PO4,KI,H2BO3，MnSO4•4H2O,ZnSO4•7H2O,Na2•MoO4•2H2O,CuSO4•5H2O,CoCl2•6H2O,Na2•EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O,维生素B6,肌醇,蒸馏水,琼脂,蔗糖,奈乙酸（NAA），升汞,苄基腺嘌呤（BA）,吲哚丁酸（IBA）,NaOH溶液五、实验步骤1、母液的配制表1母液配制表成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)母液Ⅰ母液ⅡNH4NO333000MnSO4•4H2O22300KNO338000ZnSO4•7H2O8600KH2PO43400H2BO36200MgSO4•7H2O7400KI830CaCL2•2H2O8800Na·MoO4•2H2O250CuSO4•5H2O25CoCl2•6H2O25母液Ⅳ肌醇5000烟酸25维生素B15甘氨酸100维生素B625按照上表1配成100倍母液8种，各配成1L,种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。配时要注意以下几点：a.各化合物必须充分溶解后才能混合。b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。c.混合时要慢，边搅拌边混合。MS培养基中还需要加入萘乙酸（NAA）、苄氨基嘌呤（BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液（1mg/mL）。其配制方法是：分别称取这2种物质各100mg，NAA用少量乙醇溶解，BA用少量的NaOH溶液，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100mL，即得1mg/mL的母液。2、初代培养选择露地栽培生长旺盛的德国鸢尾秋季萌发的幼龄株茎尖为材料,用自来水冲洗净泥土,用手术刀去须根和叶,注意保留距茎尖约1cm的材料。先用10%的洗衣粉水浸泡并搅拌消毒10min,再用自来水冲洗干净,置超净台上,在接种前用75%的酒精浸泡5min,用无菌水冲洗2次,再用0.1%的氯化汞溶液消毒10min,最后用无菌水浸泡10～15min,在浸泡时间内需经常搅动并换水3～4次。将材料取出后放置于培养皿的无菌纱布上,吸去多余的水分,然后将近茎尖约2mm区域的组织切成约2mm×2mm×2mm大小的外植体块,接种在准备好的培养基上。以MS为基本培养基,琼脂0.61%,pH5.6;培养温度22℃,光照12h。分化和增殖培养基为：BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，观察和记录增殖情况。3、生根培养将初代培养得到的不定芽接种到生根培养基上（MS+BA0.1mg/L+INA0.5mg/L）,观察和记录生根情况。4、生根苗移栽试管苗出瓶最好选择在其生长旺盛的春秋季，不定根长度达到0.5-1cm便可直接出瓶，生根苗从培养基中取出后，将根部的培养基冲洗干净，移栽到沙壤中，稍加遮荫，观察记录成活率。六、实验结果与数据处理1、德国鸢尾生长情况及记录（1）不定芽生长情况及记录观察天数第三天第五天第七天第十天第十五天……染菌数具体现象萌发数(2)不定根的培养生根情况及记录观察天数生根数生根长度2、数据处理德国鸢尾诱导率（%）=(形成不定芽数/总的接种数)*100%德国鸢尾的污染率（%）=（污染数/总接种数）*100%九、注意事项要根据培养目的适当选取材料，选择原则：1、易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。2、要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。3、要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。4、培养材料要消毒。从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上5、生长素种类、用量要适宜；pH值适宜，无机盐浓度及配比适当6、无菌操作。材料经升汞消毒后，此后的操作中的用具要求无菌，为防止污染在无菌室工作时不得将头伸入无菌操作台中。7、废液处理。酒精要回收，放回原处；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放入指定位置。8、接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的脏物掉到三角瓶中。9、操作期间应经常用75%的酒精擦拭工作台和双手，接种所用器具应反复在75%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。刚用火焰烧过的器具不能立即插入酒精中。