影响抗原热修复的关键因素

影响抗原热修复的关键因素目前免疫组织化学染色技术已经广泛应用到各级医院临床病理诊断中，但是由于实验条件的差别和传统观念的影响，使得免疫组化染色结果差别很大，从而影响到病理诊断这个“金标准”的含金量，给医院和病人带来一些不必要的损失。所以，提高免疫组织化学染色技术水平的需要变得越来越迫切。众所周知，免疫组织化学染色中最关键的步骤莫过于抗原的修复了，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，可以这样说，抗原热修复是免疫组化的关键技术，会直接影响到最终的染色结果。1、抗原热修复温度和时间的关系我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如示：上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：抗原热修复的有效性=加热温度（T）×加热时间（t）也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就会越长；反过来当修复温度增高时则修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表一中也可以清楚地看出。如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露出的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也会相应增高，这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。这就提醒我们在做回顾性研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。3、不同pH值抗原修复液对染色结果的影响抗原热修复中所使用的修复液pH值也会对染色结果产生相当大的影响。pH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。A—稳定型，pH值对染色结果的影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。B—V型，高pH值和低pH值染色较好，而pH值4-6染色结果较差，如ER、Ki-67等。C—上升型，随着pH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。D—下降型，随着pH值的增加，染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。一个有趣的现象值得注意，即在高pH值（约pH8.0~9.0），A、B、C三者都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高pH值的修复液，如1mMEDTA,pH8.0或pH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用pH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高pH值的修复液来代替目前广为使用的pH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用pH9.0的修复液效果都要优于pH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高pH值的抗原修复液是今后的必然趋势。4、抗原热修复的手段目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种，从表二中可以看出，由于高压修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点，已经越来越受到人们的青睐。5、抗原热修复具体操作过程可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以1mM的EDTA抗原修复液（pH8.0或pH9.0）效果最好。5.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法切片脱蜡至水后，蒸馏水冲洗2分钟×3。将切片放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在96℃~98℃之间并持续15~20分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却20~30分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，避免蛋白恢复至原有的空间构型）。PBS洗，3%H2O2处理10分钟，下接免疫组化染色步骤。5.2石蜡切片高压抗原修复操作方法切片脱蜡至水。将适量的抗原修复液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1.5~2.5分钟，然后将压力锅端离热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，3%H2O2处理10分钟，下接免疫组化染色步骤。5.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法切片脱蜡至水后，放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。