实验九柱层析.

柱层析（columnchromatography）一、实验目的1、了解色谱法分离、提纯有机化合物的基本原理和应用。2、掌握柱层析的操作技术。二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。色谱法须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。柱层析原理流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。几种层析柱工业上的柱层析分离装置柱层析示意图2.柱色谱分离条件⑴固定相选择柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：成盐作用配位作用氢键作用偶极作用范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。表1：各种吸附剂对于极性有机物的吸附作用强度常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。纤维素、淀粉硅酸镁硫酸钙硅胶弗罗里硅土氧化镁中性氧化铝活性炭对极性有机物的吸附作用增强色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的再重叠，适得其反。⑵流动相选择色谱分离使用的流动相又称展开剂。展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。表2：各种展开剂对极性有机物的溶解能力石油醚环己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸对极性有机物的溶解作用增强当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。显色分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F，氧化铝F等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。柱色谱操作流程—装柱6g硅胶浸泡于20mL石油醚中，搅拌均匀后一次性倒入柱中预先加入溶剂敲打均匀紧密柱色谱操作流程—装柱柱色谱操作流程--拌样溶解搅拌柱色谱操作流程--上样将约半滴管样品溶液均匀加到柱中柱色谱操作流程---洗脱与接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱（先用28mL的(2.5:1)混合液，然后用1:1的洗脱液20mL）先收集黄色带（邻硝基苯胺），如果有交叉，换接受瓶收集交叉组分。再收集浅黄色带（对硝基苯胺），减压除去溶剂。（旋转蒸发）柱色谱操作流程--浓缩浓缩方法溶剂浓缩自然挥干减压浓缩冻干