对孕妇外周血中的单个有核红细胞及游离DNA来源的鉴定

扩增孕妇血浆游离基因的结的SRY特异性为果1SRY基因的结果与胎儿实际性别的符合率为20有核46/(59/。80100%(24/30),andthespecificityratewas87.50%(14/16).(3)TheconcordancerateofSRYgene基金项目:卫生部科学基金(96122112),湖北省自然科学基金资胞的纯度不够理想,而且方法较复杂。本研究从单电・318・中华医学杂志2002年3月10日第82卷第5期NatlMedJChina,March10,2002,Vol82,No.5・论著・对孕妇外周血中的单个有核红细胞及游离DNA来源的鉴定陈汉平王陶然贺桂芳卢运萍马庭元【摘要】目的探讨孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞及游离DNA在非创伤性产前诊断的可行性。方法对116例孕妇外周血进行检测。(1)对51例14～26孕周的妇女外周血经密度梯度离心后用显微操作分离单个有核红细胞。(2)提取65例孕妇(5～40孕周)外周血血浆DNA。(3)应用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增单个有核红细胞的男性SRY基因,应用引物延伸预扩增(PEP)法及巢式PCR及游离的DNA可来自胎儿,它可成为产前诊断的胎儿物质来源。(2)单细胞分离技术使孕妇外周血中的胎儿有核红细胞的分选纯度几乎达到100%,解决了母胎细胞混合的难题,为非创伤性产前诊断提供了一条新思路。【关键词】胎儿;红细胞;性别预选;聚合酶链反应IdentificationoftheoriginofsinglenucleatedredbloodcellsandfreeDNAinperipheralbloodofpregnantwomenCHENHanping,WANGTaoran,HEGuifang,LUYunping,MATingyuan.DepartmentofGynecologyandObstetrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030China【Abstract】ObjectiveToinvestigatethefeasibilityofusingsinglefetalnucleatedredbloodcells(FNRBCs)andfreeDNAfornoninvasiveprenataldiagnosis.Methods116samplesofmaternalbloodwereanalyzed.SingleFNRBCswereisolatedfromtheperipheralbloodsamplesof51pregnantwomenwiththegestationalperiodof14to26weeksbymicromanipulationtechniquesafterdensitygradientcentrifugation.NestedpolymerasechainreactionmethodwasusedtoamplifytheSRYgene.PlasmaDNAinbloodsamplesof65pregnantwomenwiththegestationalperiodof5～40weekswereextractedandprimerextensionpreamplification(PEP)andnestedpolymerasechainreactionwereemployedtoamplifytheSRYgene.Chorionictissue/amnioticcellswereextractedtocomparetheconcordancebetweentheexaminationresultofthemeternalbloodandthatofchorionictissue/amnioticcells.Venousbloodofhealthymenandunpregnantwomenwereusedascontrols.Results(1)Thedetectionrateofsinglenucleatedredbloodcellswas90.20%(46/51).(2)TheconcordancerateofSRYgeneamplificationresultsofsinglecellswithrealfetalsexwas82.61%(38/46),thesensitivityratewasamplificationresultsoffreeDNAwithrealfetalsexwas90.77%(59/65),thesensitivityratewas89.13%(41/46),andthespecificityratewas94.74%(18/19).Conclusion(1)ThesinglenucleatedredbloodcellsandfreeDNAinmaternalbloodareoffetaloriginandcanbeoneofthevaluablematerialsourcesforprenataldiagnosis.(2)ThedetectionpurityofFNRBCbyusingmicromanipulationtechniquesisnearly100%anditprovidesanewwayfornoninvasiveprenataldiagnosis.【Keywords】Fetus;Singlecell;Erythrocytes;Sexpreselection;Polymerasechainreaction孕妇外周血中存在的胎儿细胞,被公认为是非创伤性产前诊断最理想的靶细胞。由于母血中的含量极少,富集胎儿细胞的方法成为最重要的技术,它是续后产前诊断成功的基础。目前,研究得比较多助项目(96J068)的富集方法有荧光激活细胞分选术,磁激活细胞分作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院离法、泳分离法等,但这些方法分选胎儿有核红细妇产科©1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.其中含有一对外引物(P1,P2)各016μmol/L,4种dNTP各013mmol/L,1×buffer,115mmol/LMgCL2,11对象:116例年龄为20～35岁,14～26孕周2%琼脂糖凝胶(含015μg/ml溴化乙啶)中电泳,检TGGCGATTAAGTCAAATTCGC3′;P4:5′CTAGTACCC2CAGTCTGAAGCGGGAGCACTA2ACAGT3′;Olympus光学显微镜,XDS21倒置显微镜,MJ41方法:(1)51例孕妇血中FNRBC检测:①外51统计学处理:将单细胞与游离DNA来源的90119%。10例未孕妇女血样中均未发现NRBC。DNA:单个细胞放入装有5μ的014μg/μ的蛋白酶NRBC与母血l肾肝llll;ll各l;(;;l单46中华医学杂志2002年3月10日第82卷第5期NatlMedJChina,March10,2002,Vol82,No.5・319・个细胞水平分选胎儿有核红细胞,使胎儿细胞的浓度和纯度有了较大的提高。并且能直接从母亲外周热30min以提取DNA。⑤巢式PCR扩增单细胞SRY基因:第1次扩增反应每管反应体积为50μl,血中提取DNA,以便寻找较简单的诊断方法。对象与方法Taq酶2U,DNA模板4μl。每个反应管加入4μlDNA模板后95℃变性5min,加Taq酶2U,石蜡油约的单胎妊娠妇女,均无严重贫血(血红蛋白均9030μ覆盖反应液面,高速离心数秒钟后在PCR扩增g/L)及心、、等系统的妊娠合并症。孕妇均取肘仪上进行热循环。扩增条件为95℃30s,55℃30s,前静脉抗凝血,其中51例取血2ml,以检测单个胎72℃1min,共30个循环周期,最后72℃延伸7min,儿有核红细胞(FNRBC)。65例取血5ml,同时取绒即完成巢式PCR第1次扩增反应。巢式PCR第2毛组织/羊水细胞,以比较母血中游离DNA与绒毛/次扩增反应加1对内引物(P3,P4),总反应体积为羊水细胞DNA的相符性。另取健康男性与未孕女25μ,取第1次扩增产物2μ为模板,进行30个周性静脉血分别作为阳性及阴性对照。期的热循环,其他反应物浓度及条件同巢式PCR第2.主要试剂:淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产1次扩增反应。取阴阳性对照,DNA分子量标准及品),瑞氏染液及缓冲液(华中科技大学同济医学院扩增产物各10μ加上样缓冲液1μ,混匀后点样于同济医院血液内科配制),4种dNTP与DNA分子量标记(上海Promega公司产品),蛋白酶K与Taq酶测是否存在SRY基因。(2)65例孕妇血中胎儿游离(美国Promega公司产品)。SRY基因内外引物2套DNA的检测:①血浆及绒毛/羊水中胎儿DNA的提(美国GIBCO和ABI公司产品)序列分别为:(1)单取按试剂盒说明进行。②血浆DNA的PEP反应:反细胞SRY引物:P1:5′GTGTCCTCTCGTTTTGTGAC3′应总体积60μ,含5μ引物、种2mmol/LdNTP3P2:5′GTAATCATCGCTGTTGAATAC3′P3:5′μ,DNA模板1pg～10μg。反应液95℃变性10min后置水中,加Taq酶5U,以30μl石蜡油覆盖反应液TGACAATGTATTC3′。2)血浆DNASRY引物:Y1:5′面,超速离心,热循环共30个周期,条件为92℃1Y2:5′min,37℃2min,55℃4min。PEP产物置4℃保存。CTGCGAGAAGCAGACTGCCCATTCTT3′Y1N:5′③对PEP产物的SRY靶序列套式PCR电泳:扩增TATGAACACATTCATCCTGTGGTC3′Y2N:5′PEP后血浆游离DNA的产物和绒毛/羊水细胞的CTGDGAGAAGCAGACTGCCCATCTT3′。SRY基因保守区351bpDNA片段和254bpDNA片3.主要仪器:细胞制片机(同济医科大学研制),段。总体积50μ,二次扩增。具体方法按说明书进行,判断样品中是否存在男性SRY基因。④胎儿实ResearchPCR扩增仪,电泳仪等。际性别分别由绒毛/羊水细胞检测结果及出生性别决定。周血单个核细胞甩片:所取血样用PBS以1∶1比例稀释混匀后缓慢层铺于淋巴细胞分离液表面,以SRY基因检测所得的男胎阳性率与女胎阴性率作卡3000r/min速度离心30min后取单个核细胞层,用方检验。PBS洗涤2次,以600r/min速度甩片7min。②观察结果有核红细胞的形态:细胞甩片作瑞氏染色,在光学显微镜下观察有核红细胞的形态特点。在高倍视野下一、个核细胞甩片检查分别计算胎儿有核红细胞与有核细胞的个数,并计在光镜下90%以上为成熟的淋巴细胞,还有少算出比率。③显微操作分离单个胎儿有核红细胞:量的中性粒细胞及单核细胞。在51例孕妇样本中在400倍数的倒置显微镜下用直径约10～15μm的46例被发现有1～8个NRBC(图1),占总例数的吸管吸取单个胎儿有核红细胞。④提取单细胞K与17μmol/LSDS的独立EP管中。在每管液体上1%。覆盖一层石蜡油后,置50℃温育1h,然后在99℃加二、例孕妇外周血中单个有核红细胞SRY基©1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.(14/16),符合率为82161%(38/46)。子量标记;SRY阳红细胞可能来源于胎儿[1]。本研究在由孕妇外周血样制成的单个核细胞甩片中就观察到了胎儿有核红11DNA分子量标记;21阳性对照;31阴性对照;4、1的工作,可以发现对孕妇外