基因工程基本操作程序知识总结

1基因工程操作程序知识总结目的基因：指编码蛋白质结构基因基因文库基因组文库从基因文库中获取目的基因的获取方法部分基因文库人工合成PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。利用PCR技术扩增目的基因目的：获取大量的目的基因原理：DNA复制过程目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，基因表达载体的构建并使目的基因能够表达和发挥作用。（基因工程的核心）目的基因：启动子：基因表达载体的组成：目的基因：终止子：标记基因：转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程农杆菌转化法导入植物细胞的方法：基因枪法将目的基因导入受体细胞方法：花粉通道法导入动物细胞的方法：显微注射技术导入微生物的方法：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因检测：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物DNA）目的基因的检测和鉴定检测目的基因是否转录方法：分子杂交技术（DNA探针+转基因生物mRNA）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原—抗体杂交外显子与内含子鉴定：对生物进行个体水平的鉴定一般来说，结构基因都是由外显子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系不是完全固定不变的。有时同一条DNA链上的某一段DNA序列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因时，则是内含子，结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNA。2．原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点原核细胞的基因真核细胞的基因不同点编码区连续；结构简单编码区有间隔，不连续；结构复杂相同点都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息表达的核苷酸序列；编码区上游都有与RNA聚合酶结合的位点2考点梳理（一）DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）主要是从原核生物中分离纯化来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。2．DNA连接酶——“分子缝合针”（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。3．运载体（运输工具）：质粒、噬菌体和动、植物病毒等（1）必备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；④对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。（2）常用运载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。(二)基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取：①直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中调用目的基因；②以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；③利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；④化学合成。获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建（1）表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因①复制起始位点即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。②启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录③终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录3④目的基因中的标记基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。（2）构建步骤：①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。②用，产生相同的黏性末端。③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。3．将目的基因导入受体细胞）受体种类不同，导入方法不同受体细胞种类方法植物细胞（1）农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和表达（2）基因枪法（3）花粉管通道法动物细胞显微注射法：目的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→新性状动物微生物细胞Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子（2）受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。植物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养成为完整个体）动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到严格限制）（3）转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中4．目的基因的检测与表达①首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。②其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。③最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。④有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）蛋白质工程1．实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。2．基本原理：预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质3．应用（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。（2）合成嵌合抗体。（3）改变蛋白质的活性。（四）蛋白质工程与基因工程区别蛋白质工程基因工程实质通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达结果合成自然界不存在的蛋白质只能生产自然界已存在的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程4