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目录摘要………………………………………………………………………1关键词……………………………………………………………………1Abstract………………………………………………………………1Keywords…………………………………………………………………1引言…………………………………………………………………………11材料与方法………………………………………………………………21.主要仪器和试剂…………………………………………………………21.1.1主要仪器………………………………………………………21.1.2主要试剂………………………………………………………21.1.3主要试剂的配制………………………………………………31.2实验方法…………………………………………………………31.2.1枯草芽孢杆菌的分离…………………………………………31.2.2染色体DNA的提取……………………………………………41.2.3分光光度计检测DNA纯度……………………………………41.2.4DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………………52结果与讨论……………………………………………………………………52.1菌株的鉴定结果……………………………………………………………52.2分光光度计法检测结果与分析……………………………………………52.3染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳结果与分析……………………………52.4关于DNA提取过程的讨论……………………………………………6参考文献………………………………………………………………………7致谢……………………………………………………………………7枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取1枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取生物科学专业学生宋验红指导教师孙迅摘要：从土壤中分离纯化并初步鉴定了一株枯草芽孢杆菌，用溶菌酶裂解该菌株，用蛋白酶K和RNaseA分别水解去除蛋白质和RNA，用分光光度计检测DNA的纯度和浓度，做琼脂糖凝胶电泳，检测DNA样品的质量。结果显示，从50mL菌液中提取出10μgDNA,并获得了较完整的琼脂糖凝胶电泳DNA条带。关键词：枯草芽孢杆菌,染色体DNA,提取,琼脂糖凝胶电泳TheextractionofchromosomalDNAinBacillussubtilisStudentmajoringinBiologyScienceSongYanhongTutorSunXunAbstract：Bacillussubtiliswasisolatedfromsoilandidentifiedpreliminarily.Thestrainwascatalyticallydissolvedbylysozyme,andtheproteinandRNAinthecellwerehydrolyticallyremovedbyproteinaseKandRNaseA,respectively.Theresultsshowedthat10μgofchromosomalDNAofbacillussubtiliswasextractedoutfrom50mLofthestrainculturebyspectrometry,andtheDNAsamplewascompletethroughagarosegelelectrophoresis.Keywords：bacillussubtilis，chromosomalDNA，extraction，agarosegelelectrophoresis引言芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年,Ehrenberg所描述的Vibriosubtilis即是现在大家熟悉的枯草芽孢杆菌,它是由Cohn于1872年正式命名的,现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae)的模式菌株[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是芽孢杆菌属的一种，从生物学特性来讲,枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征,其细胞呈直杆状。单个细胞0.7-0.8×2-3微米。着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米。椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，微白色或微黄色，在液体培养基菏泽学院本科生毕业设计（论文）2中生长时，常形成皱醭。可分解淀粉，为典型的好氧菌[2]。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史,早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来,对枯草芽孢杆菌研究渐进到遗传学与分子生物学领域,研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等[3-4]。1997年,KunstF.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定,并将结果发表在Nature杂志上[5]。随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入开展,发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值[6]。生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。从细菌、植物和哺乳动物细胞中提取基因组DNA可分两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的方法，去除蛋白质、RNA以及其他的大分子。掌握染色体DNA的提取方法，制备高质量的基因组DNA，可用作PCR扩增的模板，还可用于构建基因文库以及进行DNA印迹（Southernblotting)的材料。1材料与方法1.1主要仪器及试剂1.1.1仪器立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；冰箱（海信北京电器有限公司）；紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；高速冷冻离心机（美国sigma公司）；分析天平(上海精天电子仪器有限公司）；微波炉（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）；电泳仪DYY–III5型（北京六一仪器厂）；水平板电泳槽（北京六一仪器厂）；生化培养箱HPS-160（哈尔滨东联电子技术公司）、80mL离心管和2mL离心管。1.1.2主要试剂TE缓冲液、GTE溶液、10%SDS（m/v)、酚/氯仿/异戊醇=25:24:1，氯仿/异戊醇(24:1,体积比）、预冷的70%乙醇、预冷的无水乙醇、3mol/L醋酸钠（pH5.2)、SC溶液、4mol/LNaCl、溶菌酶（50mg/mL，新鲜配制）、1mg/mL溴化乙锭（EB),枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取3饱和酚、异丙醇、蛋白酶K(10mg/mL）、RNaseA（1mg/mL）、LB液体培养基等。1.1.3主要试剂的配制1.1.3.1饱和酚溶液[7]取100mL新鲜酚倒入分液漏斗中，加8-羟基喹啉至终浓溶度为0.1%（m/v),溶解混匀，此时溶液呈淡黄色，加入等体积的0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液，反复混匀后，静止分层，放出下层黄色酚液，弃上层；再加入0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液,0.2%的β-巯基乙醇溶液，重复上一步；直至下层酚相的pH＞7.6-7.8；收集下层的黄色酚液，装于棕色试剂瓶中；加入少量0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）覆盖在酚液的表面，置4°C冰箱中保存。1.1.3.21MTris-HCl缓冲液(pH8.0)在800mL水中溶解121.91gTris碱（三羟甲基氨基甲烷，分子量121.14），加入浓盐酸，调pH至所需值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。1.1.3.30.5MEDTA(pH8.0)在800mL水中加入186.1g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.2）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约20g)，然后定容到1L,分装后高压灭菌。1.1.3.4GTE溶液50mmol/L的葡萄糖、25mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L的EDTA(pH8.0)。1.1.3.5LB液体培养基称取蛋白胨2g,酵母膏1g,NaCl2g,蒸馏水200mL，用NaOH调pH7.2，分装到4个锥形瓶中，121°C灭菌30min。1.2实验方法1.2.1枯草芽孢杆菌的分离（1）配制培养基：配制500mL培养基，称取淀粉10g、硫酸铵1g、磷酸氢二钠0.5g、酵母粉0.25g、琼脂10g。称量好后加去离子水定容到500mL，分装到两个锥形瓶中，然后高压灭菌锅121°C灭菌30min，倒平板[8]。（2）配制无菌水200mL，121°C灭菌30min后备用；另包扎好培养皿，移液管，涂布棒等用品灭菌后，烘干备用。（3）制备土壤菌悬液：称取样品5g（液体样品5mL），放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为10-1的土壤稀释液。（4）取45mL无菌水4瓶，用记号笔编上10-2，10-3，10-4，10-5。（5）取10-1稀释液，振荡后静止2min，用无菌移液管吸取5mL上层细胞悬液加至装有45mL无菌水的试管中，制成10-2稀释液。同法一次稀释至各浓度。菏泽学院本科生毕业设计（论文）4（6）另取移液管，分别以无菌操作法吸取10-5，10-4，10-3的稀释液0.1mL，加至制备好的平板上，用无菌刮刀（涂布棒）涂布均匀。（7）将培养皿倒置于恒温培养箱中，于37°C，培养1-2天。（8）根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应培养基的平板上划线，直至得到纯培养。然后对该菌落进行形态学以及生理生化反应（芽孢染色，革兰氏染色，淀粉酶水解反应观察透明圈大小）鉴定，确定为枯草芽孢杆菌后，将菌株及时转接到斜面培养基上保存。1.2.2染色体DNA的提取（1）挑取枯草芽孢杆菌菌株的1个菌落于装有50mLLB液体培养基的锥形瓶中，37°C振荡培养过夜（12-16h）。（2）吸取1mL的过夜培养物于离心管中，10000r/min，离心1min，收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀。（3）加入100μLGTE溶液，混匀至彻底分散。（4）再加入500μLGTE溶液，振荡混匀（注意不要残留细小菌块）。（5）向悬液中加入6μL的50mg/mL溶菌酶至终质量浓度为1mg/mL，混匀，37°C温浴40min。（6）在向悬液中加入6μL的蛋白酶K至终质量浓度为0.1mg/mL，混匀，55°C温浴1h，中间轻缓颠倒微量离心管数次。（7）温浴结束后向溶液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（去除蛋白质和脂质），旋锅混匀，12000r/min，离心5min,将上清液转移到另一1.5mL的微量离心管中，然后再用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（8）取上清液用等体积的氯仿/异戊醇溶液抽提一次。（9）取上清液至新的离心管中，向上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2)，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20°C静置30min沉淀DNA，取出，4°C，10000r/min，离心10min[9]。（10）小心弃去上清液，用1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，4°C，10000r/min离心5min。自然干燥除去乙醇。（11）用含有RNaseA（至终质量浓度为20μg/mL)的TE溶解，37°C温浴40min，除去RNA。（12）将样品贮存于4°C冰箱中。1.2.3分光光度计检测DNA纯度[10]取30μLDNA样品，加TE缓冲液至3mL，转入分光光度计的石英比色杯中；然后分光光度计也用TE缓冲液校正零点；在260nm和280nm分别读出光密度值，依据OD260,OD280以及OD260/OD280的比值检测制备的总DNA样品的浓度和纯枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取5度。1.2.4DNA的琼脂糖凝胶电泳（1）制胶：称取0.4g琼脂糖，加入50mL1×TAE缓冲液微波炉加热，冷却至60°C时倒