1-1工具酶

基因工程的基本原理D基因工程的支撑技术基因工程的基本原理C基因工程的基本原理B基因的分子生物学A重组DNA技术的理论基础A重组DNA技术的理论基础2基因工程的基本原理19世纪中孟德尔豌豆杂交试验遗传因子经典遗传学20世纪初摩尔根果蝇杂交实验基因基因学1944年艾弗瑞肺炎双球菌转化实验遗传物质DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶DNA分子体外拼接基因工程分子遗传学1953年沃森-克瑞克DNA双螺旋结构分子生物学B基因的分子生物学2基因工程的基本原理C基因工程的基本原理2基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等SD序列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理——分子生物学原理四大要素目的基因载体工具酶受体细胞六步过程分（分离）切（酶切）连（连接）转（转化）选（筛选）验（验证）基因工程四大要素工具酶基因载体宿主细胞基因工程工具酶限制性内切核酸酶是基因工程中的分子手术刀，是基因操作的主要工具。讨论限制性内切核酸酶的发现、分离、分类、命名及功能。同时还讨论II类酶的作用机制及应用等。限制性内切酶限制性内切酶凡是能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，称为限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases，RE）。简称限制性内切酶或限制酶。一、限制性内切酶的命名限制性内切酶命名的次序如下：用3个字母代表来源的生物（如Bam代表Bacillusamyloliquefaciens）1个字母或阿拉伯数字代表菌株（BamH）1个罗马字母代表发现或鉴定的次序（BamHI）Haemophilusninfluenzaed（流感嗜血杆菌）（属名）（种名）（株系）HindHind二、限制性内切酶的分类亚基组成酶切位置识别位点辅助因子等表三类限制性内切酶的特性酶的性质酶的类型IIIIII1.酶的组成2.DNA底物3.辅因子4.识别序列5.切割位点6.甲基化三种不同的亚基双链DNAMg2+、ATP、SAM特异非特定（位于识别序列前或后100～1000bp范围内）同时具有甲基化酶作用两种相同的亚基双链DNAMg2+特异特定（位于识别序列之中或接近）不具有甲基化酶作用两种不同的亚基双链DNAMg2+、ATP特异特定（位于识别序列之后25～27bp内）同时具有甲基化酶作用三、限制性内切酶特点识别特异性能够识别双链DNA分子中的特异序列。这些序列大多呈回文结构，也就是说，序列正读和反读是一样的。5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’三、限制性内切酶特点识别序列长度限制酶的识别序列一般为4～8个核苷酸。切割特异性在特定部位上水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键，从而造成双链缺口，切断DNA分子。EcoRⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子：5’-G-A-A-T-T-C-OH3’5’-G-OH-A-A-T-T-C-OH3’3’HO-C-T-T-A-A-G-5’3’HO-C-T-T-A-A-HO-G-5’‖‖‖‖○P○P○P3’5’5’3’○P○P○P粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力四、一些概念四、一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力5’-G-A-A-T-T-C-3’EcoRI5’-G-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-G-5’3’-C-T-T-A-AG-5’5’5’‖‖‖‖粘性末端（cohesiveend）5‘突出粘性末端：限制性内切酶在两条链双重对称轴上同时从5‘侧切断双链DNA的每条链的磷酸二酯键，双链DNA交错断开，形成5’端具有2～5个核苷酸单链的粘性末端的片段。5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-PHO-G-C-T-C…5’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPPOH退火4-7℃3‘突出粘性末端：限制性内切酶在两条链双重对称轴上同时从3’侧切断双链DNA的每条链的磷酸二酯键，双链DNA交错断开，形成3’端具有2～5个核苷酸单链的粘性末端的片段。‖‖‖‖5’-C-T-G-C-A-G-3’PstI5’-C-T-G-C-AC-3’3’-G-A-C-G-T-C-5’3’-GA-C-G-T-G-5’3’3’PstI37℃OHPPOH退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3’…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’平端（bluntend或flushend）限制性内切酶在两条链双重对称轴上同时切断双链DNA的每条链的磷酸二酯键，形成具有平端的片段。5’-C-C-C-G-G-G-3’SmalI5’-C-C-CG-G-G-3’3’-G-G-G-C-C-C-5’3’-G-G-GC-C-C-5’5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-PHO-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃OHPPOH退火4-7℃5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-CG-A-C-C-T-C…5’同裂酶两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。同尾酶两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶。可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC）、SpeⅠ(A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即BfaⅠ（C`TAG)的酶切位点。限制性内切酶的星号活力限制性内切酶的星号活力（staractivity）第二活力（secondaryactivity）指酶反应条件改变时，酶的识别特异性降低，使酶在DNA分子中的切点数增加。如EcoRI正常识别序列为GAATTC，而星号活力识别序列为AATT。甘油浓度过高酶切反应的体积至少要比限制性内切酶本身体积大十倍酶单位数/DNA比值过高，超过10U/mgDNA低离子强度，小于25mmol/L高pH值（pH8.0）有机溶剂的存在二价离子的改变多种因素的单一或综合作用都会引起某些酶出现星号活力造成星号活力的因素五、酶活性单位的定义限制性内切酶活性单位的定义是指在50ml缓冲液中含1mg底物l-DNA，于最适反应条件和温度下保温1小时，能使1mgl-DNA完全降解所需的酶量，即为一个酶单位。上述酶量并不一定能完全降解1mg其它种类的DNA六、限制性内切酶的数据库rebase.neb.com/rebase含有已知的所有限制性内切酶的完整表，包括识别的序列，甲基化的敏感性，商业信息和参考文献。七、限制性内切酶的反应条件大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0～150mmol/LDTT1mmol/LVolume20～100µlT37℃T1～1.5h0-50mmol/L低盐酶100mmol/L中盐酶150mmol/L高盐酶II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5mol/LNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA的纯度和物理特性DNA的纯度待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA浓度的影响一般在DNA限制性内切酶酶解反应中常常是酶过量于底物，这样就可以不考虑底物浓度对反应的影响。不过当DNA浓度过大时，会抑制某些酶的活力。因为高分子量DNA浓度较高时使反应液粘度增加，抑制了酶分子的扩散而导致酶解反应不完全。DNA构型和分子的结构一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1mgl-DNA，需要1-2单位的酶，酶切1mg质粒DNA，需要3-5单位的酶。限制性内切酶能识别双链DNA上特定序列，但是同一条链上不同部位的识别序列被酶解的速度并不一致。例如：l-DNA上有5个EcoRI的切点，其中有2个切口的反应速度可相差10倍。XmaIII的识别序列为CGGCCG，但是在含GGCGGCCGCC序列中识别序列就不被XmaIII切割。说明识别序列周围的结构会影响酶的反应。2.缓冲体系限制性内切酶的缓冲液组成包括：MgCl2、NaCl、Tris-HCl、b-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、牛血清蛋白（BSA）等。Tris-HCl缓冲体系使在pH7.4～8.0范围内有较大的缓冲能力，使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。Mg2+是辅因子，一般浓度为5mmol/L以上，反应中不能加入EDTA，它能与Mg2+结合，从而降低游离的Mg2+浓度，使活性下降。巯基试剂可保持某些限制性内切酶的稳定性，一般浓度为5～10mmol/Lb-巯基乙醇或1.0～2.0mmol/L二硫苏糖醇。牛血清蛋白可稳定酶活性，对保存和催化反应都有稳定作用，有些酶当蛋白质浓度低于20mg/ml时就极不稳定，加入牛血清蛋白的保护作用可减少蛋白水解酶对限制性内切酶的水解，也能减轻非特异性吸附。常用的牛血清蛋白量为50～100mg/ml。NaCl提供一定的离子浓度，不同的限制性内切酶要求的NaCl浓度不同。每种酶在不同的盐浓度缓冲液中的活力不同，要选用合适盐浓度的缓冲液。个别的限制性内切酶需要其它离子，如：SmalI绝对地需要K+，PstI更容易被NH4+激活。一般购买的限制性内切酶都附带有相应的缓冲液，每种酶只能使用其对应的缓冲页，不能混用。DNA酶切反应的温度是影响限制性内切酶活性的重要因素。不同的限制性内切酶具有不同的最适反应温度。大多数酶标准反应温度是37℃；有些酶最适反应温度低于37℃，如：SmalI25℃、ApaI30℃有些酶最适反应温度高于37℃，如：BclI50℃、