质粒的限制性内切酶反应

分子生物学实验实验质粒的限制性内切酶反应分析实验结果与讨论实验步骤实验仪器与试剂实验原理实验目的分子生物学实验实验目的1、掌握限制性内切酶的工作原理，掌握酶切体系建立原则2、熟悉基因工程所用的限制酶的特点分子生物学实验实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。分子生物学实验限制性内切酶可分为三类限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000bpYesⅡ类(93%)内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7bp非对称在识别位点下游24-26bpYes分子生物学实验Ⅱ类限制性内切酶分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5'…GAATTC…3‘→5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'→3'…CTTAAG…5'分子生物学实验HindIII:AAGCTTTTCGAAEcoRV:GATAGCCTATAGSmaI(30℃)CCCGGGGGGCCC分子生物学实验限制酶的命名是根据细菌种类而定，一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。分子生物学实验实验仪器与试剂仪器：恒温水浴锅、离心管、移液器、枪头、离心机、电泳设备等。试剂：pUC19质粒，EcoRI酶，酶切缓冲液，琼脂糖，电泳缓冲液，EB，10x上样缓冲液，无菌水等。分子生物学实验实验步骤1、在一个洁净的0.5ml离心管中混匀下列反应物反应物体积（µl）ddH2O510×Buffer1.5质粒DNA(1μg)8EcoRI(10U)0.5最终至15µl6000rpm/min稍离15s，将反应物置于37℃水浴中温浴1～2hr。分子生物学实验实验步骤2、6000rpm/min稍离15s，将反应物置于37℃水浴中温浴1～2hr。3、配胶：称取1.4g琼脂糖粉末，加入160ml1xTAE（配2瓶），反复煮沸三次后，待冷却至约60℃后，倒胶，等待凝固（约30min），得到1%凝胶。4、酶切完成后，稍离，加入2µl10x上样缓冲液混匀，然后上样。另上样20µlMarker，以及1份10µl质粒（混合2µl10x上样缓冲液）作为对照，120V电泳1hr。5、在紫外分析仪（凝胶成像系统）上观察酶切的结果。分子生物学实验电泳检测示例分子生物学实验注意事项1、内切酶要保持在冰浴上，避免长时间置于高温中。2、加样时枪头直接垂直伸入EP管底部，避免碰到管壁，每加完一个样要更换枪头。同时要记住加样的顺序，以免漏加或错加。3、加样时酶最后加，并且加完酶后要用枪头充分混匀。4、注意酶的用量、消化反应温度和时间。限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶,消化1～2hr。过少酶切不完全，过多会产生“星号活性”。分子生物学实验星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。-----非特异性酶量过大：≧25U/μgDNA(较高的甘油浓度)低盐浓度（25mM）高pH值（pH8.0）存在有机溶剂分子生物学实验思考题如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全,你认为可能是什么原因？