第一章基因工程概述

基因工程考核方法平时成绩10%100%实验成绩20%闭卷考试70%考勤，平时作业考勤、实验结果、报告待定主要参考资料张惠展。基因工程。高教出版社。王关林等.植物基因工程.科学出版社。吴乃虎等.基因工程原理.科学出版社。T.A.Brown,魏群等基因克隆和DNA分析高教出版社•生物技术通报•中国生物工程杂志•农业生物技术学报•生物工程学报•生物技术•遗传•Moleculargeneticsandgenomics•Animalbiotechnology•Naturegenetics•Plantcell•Science•Nature《基因工程》第一章基因工程概述第二章DNA重组克隆的单元操作1.基因工程的载体和工具酶2.基因工程的常规技术第三章基因在大肠杆菌中的表达第四章基因在酵母中的表达第五章转基因植物第六章转基因动物第七章第二代基因工程第八章第三代基因工程第一章基因工程概述第一节基因工程的诞生和发展第二节基因工程的研究内容、基本原理、基因工程的成就和前景展望第一节基因工程的诞生和发展一、基因顺反子阶段摩尔根的基因阶段孟德尔遗传因子阶段现代基因阶段基因的研究MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。Mendel的遗传因子阶段1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。1909年丹麦遗传学家Johannsen(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。但没有提出基因的物质概念。Morgan的基因阶段1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。连锁遗传规律的提出顺反子阶段1957年，本泽尔（SeymourBenzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。现代基因阶段1．操纵子（调节基因＋操纵基因＋结构基因）现代基因阶段2．跳跃基因指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。3．断裂基因1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。4．假基因不能合成出功能蛋白质的失活基因。5．重叠基因不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。一般认为1973年是基因工程诞生的元年（S.Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。二、基因工程的诞生1944年，AveryO.T.利用肺炎双球菌转化实验1、DNA是遗传物质被证实40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。Watson和Crick2、DNA双螺旋模型的提出50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。Nireberg等为代表的一批科学家3、“中心法则”和“操纵子学说”的提出60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）既然，DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。原核生物的基因调控操纵子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因调控的操纵子模型（operonmodel）。1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，H.W.Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。4、工具酶的发现和应用1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。4、工具酶的发现和应用1970年，Baltimore等和Temin等在RNA肿瘤病毒中各自发现了反转录酶，完善了中心法则，用于构建cDNA文库。4、工具酶的发现和应用载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；5、载体的发现及其应用6、重组子导入受体细胞技术1944年，肺炎链球菌被成功转化。1970年，大肠杆菌才被成功转化，得益于CaCl2的应用(二)、基因工程诞生的标志1972年，P.Berg等，成功地实现了DNA的体外重组。用限制性核酸内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，从而获得第一个体外重组的杂种DNA分子。他们因此获得1980年诺贝尔化学奖(同Sanger、Gilbert分享)。1973年，S.Cohen等，史上第一次实现重组体转化成功的实验。SV40λ噬菌体EcoRIEcoRIT4连接酶第一个重组分子第一个转化成功的重组DNA分子(三)、基因工程的成熟1981年，转基因鼠1983年，KB.Mullis发明PCR仪，于1993年获诺贝尔化学奖。人类基因组计划（HGP）2001年２月１２日，中、美、日、德、法、英６国科学家和美国塞莱拉公司联合公布了人类基因组图谱及初步分析结果：人类基因组包含了大约３万到４万个基因，它们由３２亿个碱基对组成。这是人类在探索自身奥秘过程中又向纵深迈进了一大步。预计整个人类基因组的完成图可于２００３年绘就.(四)、进入第二代基因工程（蛋白质工程）(五)、进入第三代基因工程（途径工程）第二节基因工程的研究内容一、基因工程的概念(狭义)在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。(广义)下游产业化一、基因工程的概念生物工程biologicalengineering遗传工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重组DNA技术recombinantDNAtechnique二、基因工程研究的基本步骤1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。三、基因工程的基本流程基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞基因工程操作流程转连三大要素载体供体受体基因工程的技术路线合成基因基因组DNA组织、器官、细胞mRNAcDNA合成文库、基因组文库、cDNA文库目的基因克隆目的基因转化或转染原核细胞表达真核细胞表达植物中表达动物中表达人体表达构建优化载体寡聚核苷酸探针DNA序列筛选基因工程的基本原理1.主要研究内容目的基因的制备和分离；选择或改造表达载体，将目的基因插入到表达载体上；重组DNA导入宿主细胞；重组体筛选和鉴定；外源基因的在宿主细胞中表达2.提高外源目的基因稳定高效表达的策略：寻找最佳培养工程菌的工程和工艺条件，从而年提高工程菌的增殖和代谢速度，达到了外源基因的最佳表达。受体细胞中载体DNA独立于染色体外而有自主复制特性，提高外源基因在受体细胞中的拷贝数；通过对基因转录调控元件如启动子、增强子等的筛选，突变和重组，然后与外源基因精细拼接，起到强化外源基因的转录，并提高表达水平；通过对基因翻译元件如核糖体结合位点及密码子等的选择，突变和重组，使外源蛋白在细胞中大量合成；第三节基因工程的成就和研究进展成就：在医药领域在农业领域在工业领域研究进展：主要讲中国的1、基因工程的应用性研究a、基因工程药物的研究b、基因诊断和基因治疗PCR诊断关键是设计合成待鉴定病原菌特异序列的引物。对细菌性疾病的诊断可以防止抗生素的滥用，能检测出病原菌是否带有抗药性基因。利用待测菌不同特异片段，设计多对引物即套式PCR，能够增大检测的准确性。基因治疗美国国立卫生研究院给一名患有先天性重度联合免疫缺陷病的4岁女孩实施了首例基因治疗。这种疾病因腺苷脱氨酶（ADA）基因变异引起。c、转基因植物转基因植物抗除草剂的水稻d、转基因动物和器官移植器官移植器官再造艾妮莎．艾亚拉（AnissaAyala）的故事：1988年的春天，艾妮莎还是一名高二的学生时，突然患了骨髓淋巴癌。要彻底治疗，必须彻底清除其原有的骨髓干细胞，换以新的相容的骨髓细胞。艾妮莎的父母四处奔走，搜寻骨髓捐赠者，但两年的努力均告失败。艾妮莎的45岁的父亲与42岁的母亲决心与命运一博，再度怀孕，于1990年4月生下了艾妮莎的妹妹玛瑞莎。14个月以后，妹妹与姐姐做了骨髓移植手术，艾妮莎终于健康地活下来了。动物器官反应器：血液反应器和乳腺反应器意大利医生塞维里诺·安蒂诺里3/9/02法国科学家布里吉特·布瓦瑟利耶2002年12月25日通过电话告诉法新社，世界上第一个克隆婴儿“夏娃”已经降生。03年1月3日她又宣布，第二个克隆人降生。克隆婴儿克隆的正面影响再生人类，抚平丧子之痛试管婴儿，不孕者的救星冷冻胚胎，优生选择代理母亲，借腹怀胎复制明星，圆追星梦添加基因，创基因贵族基因再造，器官移植试管婴儿冷冻受精卵，筛选胚胎订做亲爱宝贝---爱丽丝的故事：对冷冻胚胎的身高，体重，外表，生理及身体的特征，天生的性格与智能特征，易患复杂及传染疾病的先天倾向，单一基因严重异常的概率等作一预测与综合评价，从而决定选择哪一个受精卵进行胚胎移植。代理孕母到1996年4月为止，美国比佛利山“代理孕母暨捐卵中心”已经安排了456例代理孕母宝宝的诞生；而在肯塔基州，代理孕母协会也已安排了500多例宝宝出生。美国的代理孕母产业方兴未艾，从Internet网上可找到美国代理孕母中心公司的网址：上面列有各州代理孕母中介商和全套服务的经纪商。克隆的负面影响社会问题：基因父母，生父母，养父母伦理问题：妈妈还是姐姐或？人的价值问题：买卖的商品而非爱的结晶？个性的发挥等。人的进化问题e、基因工程其他领域的应用研究：能源、材料、环保、酶制剂等。基因工程产品的管理与安全性问题基因工程产品与环境基因工程产品与遗传多样性基因诊断与个人隐私美