生物无机化学9第八章 铜蛋白

第八章含铜蛋白及含铜酶含铜蛋白和含铜酶广泛存在于自然界中，铜在生物体内的含量仅次于铁和锌，在过渡金属中居第三位。铜蛋白和铜酶涉及生物体内的电子传递、氧化还原、氧分子的运送及活化等过程。根据铜蛋白和铜酶的吸收光谱性质的不同，一般将铜蛋白和铜酶所含的铜分为三种类型：I型、II型和III型。在600nm附近有非常强的吸收，而且其超精细偶合常数很小的铜蛋白中所含的铜被称为I型铜。与一般铜配合物相似的吸收系数和超精细偶合常数的铜蛋白中所含的铜被称为II型铜。同时含有两个铜离子，而且两个铜离子之间有反铁磁性相互作用，并在350nm附近有强吸收峰的铜被称为III型铜。有的铜蛋白中只含有一种铜，而有的铜蛋白中同时含有多种类型的铜，如抗坏血酸氧化酶等，含有多种铜的蛋白被称为多铜蛋白。第一节含铜电子传递蛋白－－I型铜蛋白第二节铜锌超氧化物歧化酶－－II型铜蛋白第三节含铜氧载体－－III型铜蛋白第四节多铜蛋白第五节SOD的应用第一节含铜电子传递蛋白－－I型铜蛋白目前已知含I型铜的蛋白都是参与电子传递反应的铜蛋白，该类蛋白通常呈深蓝色，因此也被称为蓝铜蛋白。(1)紫外光谱在590～625nm范围内有很强的LMCT吸收（配体到金属的核移跃迁）；(2)电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细偶合常数非常小，这是由于Cu-S键的共价性较大、Cu-S键长较短造成的；(3)与一般铜配合物的氧化还原电位（约160mV）相比，I型铜蛋白的氧化还原电位都比较高（200～700mV）。蓝铜蛋白（I型铜蛋白）的谱学特征主要有：根据晶体结构，I型铜蛋白中铜的配位环境为N2SS*，即两个组氨酸侧链上的咪唑氮原子、一个半胱氨酸侧链上的硫原子和一个蛋氨酸侧链上的硫原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结构。(1)铜原子位于蛋白的一端，蛋白链折叠成8条链，其中7个为β折叠片，另一个为可变区域；(2)三个含配位原子的氨基酸残基半胱氨酸、组氨酸和蛋氨酸在一级结构上相距很近，并靠近蛋白链的C端，另一个组氨酸相距较远，埋于蛋白链的内部；(3)铜离子距离蛋白表面约8Ǻ，周围是疏水环境，被认为是电子传递部位。I型铜蛋白在结构上有一些共同点：一、质体蓝素质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿体。质体蓝素的分子质量约为11000Da，氧化还原电位为370mV左右。质体蓝素活性中心的铜处于变形的四面体构型，由两个组氨酸侧链上的咪唑氮原子、一个半胱氨酸侧链上的硫原子和一个蛋氨酸侧链上的硫原子与铜配位。有趣的是，氧化型质体蓝素的结构基本上不随pH变化而变化，而还原型质体蓝素的结构随pH变化而变化，当pH较低时，His87发生质子化，而且其咪唑环发生旋转不再与铜离子配位。二、阿祖林（天青蛋白）从荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等细菌中分离得到阿祖林，其相对分子质量为14600～17000，含有一个铜离子，氧化还原电位为280～340mV。在电子传递体系中，阿祖林将电子传递给细胞色素，但供电子体尚不清楚。在阿祖林的活性中心中，两个组氨酸的咪唑氮原子和一个半胱氨酸的硫原子形成一个三角形，蛋氨酸上的硫原子和一个蛋白链中的酰胺氧原子分别从三角形的两边与中心铜离子有弱配位作用。第二节铜锌超氧化物歧化酶－－II型铜蛋白与I型铜蛋白相比，II型铜蛋白活性中心在谱学上有几点变化：(1)铜的氧化还原电位向正的方向移动；(2)与铜配位的原子由硫变为氮或氧，铜采取典型的四方锥配位构型；(3)电子光谱中吸收强度减弱；(4)电子自旋光谱中超精细偶合常数变大。从功能方面看，I型铜蛋白为电子传递蛋白，而II型铜蛋白中的铜一般处于配位不饱和状态，即留有空位，从而可以结合底物分子，并进行催化反应。一、铜锌超氧化物歧化酶（铜锌SOD）SuperOxideDismutase在氧分子代谢过程中，作为不完全代谢的产物或负产物，会产生对生物体有害的超氧负离子和过氧负离子。由于这些有害物种的反应活性非常大，有必要及时、有效地清除。超氧化物歧化酶（SOD）可以有效地催化分解超氧负离子，起到保护生物体的作用。超氧化物歧化酶催化的反应式为：2O2-+2H+O2+H2O2反应中生成的过氧化氢在过氧化氢酶的作用下进一步反应，消除其毒性。(1)铜锌超氧化物歧化酶（Cu2Zn2－SOD）(2)锰超氧化物歧化酶（Mn－SOD）(3)铁超氧化物歧化酶（Fe－SOD）(4)镍超氧化物歧化酶（Ni－SOD）到目前为止已知的超氧化物歧化酶有四种：超氧物歧化酶是一种新型酶制剂，它在生物界的分布极广，几乎从人到细胞，从动物到植物,都有它的存在。原来从牛血中制取，现多从猪血中提取。哺乳动物的超氧化物歧化酶（Cu2Zn2－SOD）主要存在于肝脏、脑、血液等组织，它与超氧负离子的反应非常快，可以有效地除去超氧负离子，是一种很好的抗氧化剂，从而起到防止老化、抑制肿瘤发生等作用。铜锌超氧化物歧化酶1938年被发现，直到1969年才知道其生物活性。Cu2Zn2－SOD中含有两个相同的亚基，其中每个亚基中含有一个铜和一个锌离子。两个亚基之间主要是通过非共价键的疏水作用缔合在一起。根据晶体结构，铜锌超氧化物歧化酶每一条蛋白链中的二级结构主要为β折叠和β转角，而α螺旋结构含量很少。每一个亚基中的铜离子和锌离子通过一个组氨酸侧链上的咪唑基团桥联，二者之间的距离为6.7Ǻ，形成一种特殊的双核异金属活性中心。铜锌超氧化物歧化酶中每个铜离子与四个组氨酸侧链上的咪唑氮原子配位，形成一个变形的四边形，还有一个水分子在轴向上与铜离子配位，使铜离子为五配位的变形四方锥构型。每个锌离子为四配位的变形四面体构型，由三个组氨酸侧链的咪唑氮原子和一个天冬氨酸的羧基氧原子与锌离子配位。铜锌超氧化物歧化酶的衍生物研究发现，除去Cu2Zn2－SOD中的锌离子后，Cu2E2－SOD（E代表空位）的活性与Cu2Zn2－SOD的活性一样，表明没有锌离子并不影响酶的活性，这与超氧负离子的歧化反应发生在铜离子部位一致。锌离子在铜锌超氧化物歧化酶中可能起稳定蛋白结构的作用。红外光谱研究结果显示，除去Cu2Zn2－SOD中的铜离子后，其二级结构变化不大，而除去Cu2Zn2－SOD中的锌离子后，其二级结构发生明显变化，β折叠含量减少，而无序结构含量增加，表明锌离子对维持Cu2Zn2－SOD的二级结构起着重要作用。铜锌超氧化物歧化酶的活性可能需要两种金属的协同作用，在每一轮催化循环中，连接铜离子和锌离子的咪唑桥先被断开而后又重新形成。在桥断裂后，铜离子发生氧化还原作用，催化超氧负离子歧化反应。铜锌超氧化物歧化酶可能的桥断裂机理二、半乳糖氧化酶半乳糖氧化酶的活性中心只含有金属铜离子，是分子质量为68000Da的醇氧化酶，催化D－半乳糖氧化为D－半乳己二醛糖：半乳糖苷和二羟基丙酮都是半乳糖氧化酶良好的底物，但不能催化氧化葡萄糖。从pH为4.5的乙酸缓冲溶液中得到的半乳糖氧化酶晶体结构显示，其活性中心有两个组氨酸侧链的咪唑氮原子、一个酪氨酸侧链的氧原子和一个乙酸根与铜离子配位形成平面四边形，另一个酪氨酸侧链的氧原子参与轴向配位。在pH为7.5时，乙酸根离子被水分子取代。第三节含铜氧载体－－III型铜蛋白与I型和II型铜蛋白活性中心只含有一个铜离子不同，III型铜蛋白的主要特点是在其活性中心含有两个铜离子，并且两个铜离子之间存在强的相互作用。III型铜蛋白的典型代表有血蓝蛋白和酪氨酸酶。一、血蓝蛋白血蓝蛋白是一种氧载体，存在于蜗虫、章鱼等甲壳类和软体类动物的血液中。血蓝蛋白的相对分子质量特别大，而且亚基数可以变化，与其来源有关，不同来源的血蓝蛋白含有不同的亚基数，其中一个亚基的分子质量约为460000Da。由血蓝蛋白在脱氧状态（还原态）的晶体结构可知，其活性中心含有两个一价铜离子，Cu(I)-Cu(I)距离为4.6Ǻ，每个铜离子与三个组氨酸侧链的咪唑氮原子配位，两个铜离子之间未发现桥联配体。两个铜离子之间的空腔正好容纳一个氧分子。氧合血蓝蛋白（氧化态）中尽管铜离子为二价d9构型，但由于两个二价铜离子之间存在很强的反铁磁相互作用，以致在室温条件下，该双核铜活性中心呈抗磁性。共振拉曼光谱研究发现，氧分子结合到血蓝蛋白后，其O－O伸缩振动在750cm-1，表明氧分子以过氧负离子状态存在。16O－18O双同位素标记研究结果显示，16O－18O结合到血蓝蛋白以后只观测到一种O－O伸缩振动，因此推测氧合血蓝蛋白活性中心的结构为(μ-过氧基)双铜结构。CuIIOOCuIICuIICuIIOO模型化合物研究和氧合血蓝蛋白晶体结构证实，双核铜中心具有μ-η2:η2-过氧基结构。CuIIOOCuIICuIICuIIOO在几个氧载体中，血红蛋白和肌红蛋白中一个金属离子结合一个氧分子，而在蚯蚓血红蛋白和血蓝蛋白中两个金属离子结合一个氧分子。二、酪氨酸酶酪氨酸酶存在于哺乳动物中，具有两种不同的催化活性，它既可以催化氧化邻苯二酚（儿茶酚），又可以催化对甲苯酚的羟基化反应，即酪氨酸酶具有儿茶酚酶和甲苯酚酶的活性。L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化为L-多巴，进一步被氧化生成皮肤黑色素。酪氨酸酶的活性中心与血蓝蛋白双核铜中心类似，但在酪氨酸酶的活性中心周围更有利于外界分子、底物分子的接近，从而在双核铜部位发生催化反应。第四节多铜蛋白在I、II、III型铜蛋白和铜酶中，活性中心只含有I型、II型、III型三种类型铜的某一种，它们都是含简单铜离子的蛋白。此外，生物体系中还有一些铜酶和铜蛋白的活性中心同时含有多个铜离子，而且铜离子的类型也不同相同，称为多铜蛋白或多铜酶，例如抗坏血酸氧化酶、漆酶、血浆铜蓝蛋白等。多铜酶或多铜蛋白的共同点是底物被氧化的同时，氧分子接受四个电子还原成两分子水。如在抗坏血酸氧化酶作用下，一分子氧将两分子抗坏血酸氧化成两分子脱氧抗坏血酸，同时生成两分子水：抗坏血酸氧化酶广泛存在于植物和一些细菌中，在该酶的活性中心含有四个铜离子，而且分别属于I型、II型和III型铜。其中I型铜离子与两个组氨酸、一个半胱氨酸和一个蛋氨酸配位，II型铜离子与两个组氨酸和一个羟基或水分子配位，而III型铜离子与三个组氨酸配位。三个II型和III型铜离子形成一个三角形簇合物结构，被认为在氧分子的四电子还原生成水的过程中起决定性作用。I型铜与该铜簇合物之间距离较远，底物结合在I型铜附近，发生氧化还原反应，I型铜离子从二价被还原到一价。第五节SOD的应用SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。人时刻都在进行氧代谢，在正常生理情况下，自由基的生成与消除处于动态平衡，但随着年龄的增加或当某种外界因素的影响使氧自由基生成过多或超出清除能力或清除能力减弱时，过多的氧自由基通过损伤生命大分子、破坏细胞的结构与功能，导致疾病的发生与发展，从而加速机体老化。20世纪，科学家们提出的自由基学说比较清楚的阐明了机体疾病衰老的过程：SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。SOD可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！一、SOD与人体健康的关系SOD对健康有如下功能：提高免疫；延缓衰老；抗疲劳；降血糖；防治白内障；预防动脉硬化；防癌抗癌；去皱祛斑；促进微循环；改善内分泌；提高肺活量；防治组织重灌流损伤；防治肝损伤；护理肠胃上皮细胞免受损伤；抗烟雾损伤和清除自由基等等。研究表明，SOD与人体健康具有密切的相关性。国际生化委员会、美国联邦食品管理局称其为抗衰因子、美容娇子。SOD是中国卫生部批准的具有延缓衰老功能的部分物质之一。SOD每毫克的售价达到40美金。1、抗氧化。医学报告指出，抗氧化能力的衰退期已提前到35岁左右。光靠补充蔬果已经不足以消除人体内外共同形成的氧化压力。2、预防慢性