酶标、酶标仪、洗板机生物技术课

ELISA、酶标仪、洗板机赵文娟上海交通大学药学院原理类型试剂准备对照标本结果酶标（ELISA）ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。原理类型试剂准备对照标本结果1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断原理类型试剂准备对照标本结果ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。1.ELISA的原理原理类型试剂准备对照标本结果ELISA技术原理1.抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。2.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。3.酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4.受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。5.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。6.加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。原理类型试剂准备对照标本结果1.1抗原抗体反应1.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。原理类型试剂准备对照标本结果1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。原理类型试剂准备对照标本结果1.1.3最适比例原理类型试剂准备对照标本结果1.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。原理类型试剂准备对照标本结果2ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。原理类型试剂准备对照标本结果双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。样品（抗原）酶标抗体底物酶标仪测定OD值终止液原理类型试剂准备对照标本结果双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。原理类型试剂准备对照标本结果3.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；A（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；B（3）酶的底物；C（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液原理类型试剂准备对照标本结果3.1ELISA的试剂准备A固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。洗涤液：在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。原理类型试剂准备对照标本结果3.2ELISA的试剂准备B结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂1.酶的催化活性2.抗体（或抗原）的免疫活性3.含有或少含有游离的抗体（或抗原）4.结合物尚要有良好的稳定性。原理类型试剂准备对照标本结果酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP（辣根过氧化物酶），AP（碱性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。原理类型试剂准备对照标本结果3.3试剂准备C酶的底物DH2+H2O2D+2H2ODH2为供氧体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。E3.3.1HRP的底物HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。原理类型试剂准备对照标本结果AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。3.3.2AP的底物3.3.3酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。原理类型试剂准备对照标本结果3.4对照设定阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。原理类型试剂准备对照标本结果参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。原理类型试剂准备对照标本结果酶标基本步骤用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml37℃10～30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELX808酶标仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。原理类型试剂准备对照标本结果原理类型试剂准备对照标本结果加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。基本操作注意事项：基本操作：加样；温育；洗涤；读板；原理类型试剂准备对照标本结果温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。原理类型试剂准备对照标本结果洗涤洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质洗涤步骤：1.吸干孔内反应液；2.将洗涤液注满板孔；3.放置2min，略作摇动；4.吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。原理类型试剂准备对照标本结果洗板机手工洗涤流速较难控制，步骤繁琐且耗费时间，目前市面上多种洗板机可供选择，其中以美国宝特的BIO-TEKELX50洗板机最为突出洗板机优势：自动化控制精确度高速度快（最快小于20S每板/每循环）细胞包被层ELx50洗涤速度可调、角度最佳手工洗涤或一般机器洗涤角度不好，速度太快原理类型试剂准备对照标本结果洗板机使用注意事项1、有一定地洗涤次数：多次洗涤有利于取得好的效果，一般不超过6次。2、注意每孔的加液量：以加满为宜，但不可溢出，一般为每控300微升。3、建议在洗涤前进行位置调节，吸针要到微孔底部，以降低残留量。因为一般ELISA实验洗涤结束后要求扣板，但此步骤在PCR-ELISA中易造成污染，故残留量应尽量减少。不能象一般ELISA操作一样用力扣板。4、建议用户采用两点吸液与底部冲洗方式，以得到好的洗涤效果。5、如果作PCR-ELISA液罐应加有1%次氯酸钠，加入的量不得少于产生废液的量。每天使用完毕后应用1%次氯酸钠冲洗管路及清洗头，然后用双蒸水冲洗管路。6、定期维护、检修仪器及配件。原理类型试剂准备对照标本结果洗板机的应用范围所有涉及到96孔板换液、孵育、洗涤的实验：ELISA荧光ELISA细胞洗涤InCellWestern……原理类型试剂准备对照标本结果显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。比色/读板将96孔板正确放入酶标比色仪中，以蒸馏水校零点