第3章生物化学检验实验室基本知识-湖北中医药大学

1第二章生物化学检验实验室基本知识2本章内容概要：第一节实验用纯水第二节常用临床实验室器材（自学/复习）第三节生物化学检验试剂概述第四节参考范围和医学决定水平第五节实验方法与参考物质概述第六节实验方法的选择与评价第七节实验的临床诊断性能评价3教学目的和要求：1、掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验方法与参考物质的分级，实验误差、方法学评价指标以及五种方法学评价试验的目的、原理、操作、计算及注意事项。2、熟悉实验用纯水的等级、制备和纯度检查，化学试剂的选择、保存与配制，参考范围和医学决定水平的基本概念，实验方法与参考物质的基本概念，实验方法的正确选择，诊断试验的性能评价。3、了解参考范围的建立，溯源性、测量标准、互通性的概念，方法性能判断。4第一节实验用纯水天然水自来水实验用纯水经简单的物理、化学方法处理，除去悬浮物质和部分无机盐经蒸馏、离子交换、活性炭吸附、超滤等处理，除去杂质(悬浮物,胶体物质,溶解物质)5实验室用水等级纯水的制备方法水的纯度检查内容概括：6一、实验室用水等级表2-1美国NCCLS等级纯水的规定及用途(1985)级别Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级pH未定未定5.0～8.0电阻率(MΩ·cm,25℃,最大量)102.01.0硅(mgSiO2/L,最大量)0.050.11.0微生物含量（每毫升最大菌落数）10103未定硅（mgSiO2/L，最大量）0.050.11.0微粒0.2µm微孔膜过滤未定未定有机物质活性碳过滤未定未定用途原子吸收，火焰光度，荧光，电解质，酶，高效层析，电泳，参比液，缓冲液。一般实验室检验，器皿冲洗。器皿洗涤，要求不高的定性试验。美国国家临床实验室标准委员会（nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards，NCCLS）7表2-2中国国家验室用水GB6682-2002标准名称一级二级三级pH范围(25℃)－（未定）－5.0～7.5电导率（25℃）ms/m≤0.010.100.50电阻率（25℃，MΩ·cm）≥1010.2可氧化物质mg/L＜（以O计）－0.080.40吸光度（254nm，1cm光程）≤0.0010.01－蒸发残渣（105±25℃）mg/L≤－1.02.0可溶性硅（以SiO2计）mg/L＜0.010.02－8二、纯水的制备方法蒸馏法离子交换法其他方法：活性炭吸附法、电渗透法、超滤膜法混合纯化系统9（一）蒸馏法优点:设备简单缺点:1、挥发性物质难以去除，有离子干扰；2、耗能大，耗水多；3、需注意管道清洁纯度：0.1MΩ·cm（25℃）的蒸馏水（deionizedwater，DW）10(二)离子交换法定义：将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂质离子，称为离子交换法。原理：扩散离子交换吸附11氢型强酸性阳离子交换树脂(R—SO3H，R为母体)，其中的H+与Ca2+、Na+等金属离子发生交换反应，而将钙、钠离子除去氢氧型强碱性阴离子交换树脂(R′—NOH，R′为母体)，其中的OH-与水中的CL-、碳酸根等阴离子发生交换反应，而将它们除去：离子交换反应12优点:除了可去除杂质离子以外兼具吸附电中性杂质和过滤颗粒杂质的作用。缺点:纯度：5MΩ·cm（25℃）以上的去离子水DW2、由于离于交换为可逆反应，故去离子水并非绝对不含离子1、设备较复杂，成本较高；（目前实验室应用普遍）13（三）其他方法：在电场作用下水中各种阳离子趋向阴极，各种阴离子趋向阳极．但阳离子只能透过阳膜而被相邻的阴膜所阻，阴离子与此相反．这样，在一些隔间内集中了阳离子和阴离子，即形成含盐多的浓水，在另一些隔间内由于阴、阳离子的迁出降低了含盐量形成淡水电渗透法141、不需要消耗化学药品，设备简单，操作方便。消耗电能，当原水中盐浓度过低时，溶液电阻大，用电渗析也不经济纯度:25℃时104～105Ω·cm2、对于含盐量高的海水等用此法比用离子交换法更为经济．优点:缺点:电渗透法评价15炭吸附法:活性炭是一种非常优良的吸附剂，它是利用木炭、各种果壳和优质煤等作为原料，通过物理和化学方法对原料进行破碎、过筛、催化剂活化、漂洗、烘干和筛选等一系列工序加工制造而成。161、设备简单，操作方便。纯水制备效率低,仅作为各种制备纯水配套的一种措施.2、它具有物理吸附和化学吸附的双重特性,可以有选择的吸附气相、液相中的各种有机物质.优点:缺点:炭吸附法评价:17超滤膜法特点:仅能除去胶体细菌等大分子物质和悬浮物,所得水还需进一步纯化.也是作为各种制备纯水配套的一种措施.18混合纯化系统医用超纯水设备实验室纯水系统橱下式全自动逆渗透纯水机特点:多种方法混合纯化,可获得纯度很高的二级甚至一级纯水.电阻率大于2.0MΩ·cm（25℃）。19三、水的纯度检查水电阻率或电导率检查检测残留物含量1.电阻率工具：电导仪或兆欧表2.可溶性硅限量试验：以SiO2计。3.细菌菌落计数表示：电导率为每cm长的电导(S/cm)，电导仪的表头读数单位为µS/cm，因此电导仪读数为1时，电阻率为1×106Ω·cm=1MΩ·cm步骤：20第二节常用临床实验室器材一、微量加样器的使用微量加样器又称微量移液器、微量进样器。其下端为可装卸、可更换的尖管形移液嘴（吸头），上方是控制采样的推进按钮。有固定式和可调式两种类型，规格有µl级、ml级。21工作原理微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负压吸入定量的液体，其吸液量由活塞在活塞套内移动的距离来确定，再按下按钮使活塞向下移动，排出活塞腔内的气体而将吸头内的液体排出。221.选择在移液范围内的加样器，若为可调式则先将容量调节到所需的容量上。2.将吸头套在加样器的下端，轻轻转动后牢固地套上，确保密封。3.正式使用前需连续按动数次（不吸液体），以保持腔内外气压一致。4.用手垂直握住加样器，拇指将按钮压至第一停点（第一档位），并将吸头浸入到液面下1～3mm，再缓慢地放松按钮使之复位，等待1～2s后从液体中取出时拖靠掉吸头外部残液于被取出的容器内壁中。注意避免吸头与其他任何东西碰撞。5.将吸头移到加样容器内壁上，轻轻地将按钮压至第一停点将液体排出，等待1～2s，再把按钮压至第二停点（第二档位），排尽全部液体后，吸头应沿容器壁向上滑动取出，此时拖靠吸头内部残液于加样容器内壁中。再放松按钮使之复位，卸下吸头，完成一次操作过程。操作方法23第三节生物化学检验试剂概述化学试剂的种类与保存化学试剂的配制试剂盒的选择及评价24一、化学试剂的种类与保存1.一级优级纯（G.R）又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液.2.二级分析纯（A.R）又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析.3.三级化学纯（C.P），蓝色标签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性试验.4.四级实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低、但比工业用高，适用于一般定性实验.普通生化检验准确的定量分析或配制校准溶液（一）化学试剂的种类光谱纯试剂（S.P）、层析纯试剂（ch.p25（二）化学试剂的保存保存原则:①按液体、固体性状分类，同时按序排列并作好登记，贮于干燥阴冷处。②对于易燃、易挥发的药品应用蜡封瓶塞，贮于干燥阴冷处或冰箱内。③强酸、强碱试剂应分别存放。④剧毒药品则应由专人管理，每次使用应记录用量并做好登记。26二、化学试剂的配制配制方法：直接配制法：适用于校准液和一般试剂的配制。间接配制法：适用于不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，即先配制大概浓度，然后再用校准液标定出准确浓度。27①固体试剂恒重后准确称量②液体试剂取量时选择合适的量器准确吸取要求的体积③试剂配制的溶剂一般为蒸馏水或去离子水，应注意对蒸馏水的要求，若需其他溶剂则需注明清楚。④各类试剂分别溶解后按要求顺序混合，最后稀释至刻度。⑤配制好的试剂应在其容器上注明名称、浓度以及配制时间。注意事项：28三、试剂盒的选择及评价试剂盒定义：用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合。29（一）试剂盒的选择生化检验商品试剂盒包装类型：液体、干粉（片）、冻干。液体型试剂盒：单试剂或双试剂优点：均一性好、瓶间差异较小、重复性好、不需复溶而可避免外源性水质的影响、测定结果较为准确等不足：之处在于保存时间较短（特别是酶试剂）、不便于运输30冻干型试剂：试剂溶解后先分装成液体，再经冻干处理而成。干粉（片）型试剂：各种干燥的化学试剂经粉碎混合（压片）而成优点：易于保存。不足：分装过程中的称量以及加工过程中的混合均易造成瓶间差；复溶对水的质与量要求较高，同时复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。优点：易于保存，各组份的混合相当均匀不足：试剂中残留的含水量不易准确控制，易造成瓶间差；复溶对水的质与量要求较高复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。31（二）试剂盒的评价1.初步检查完整牢固的内外包装详尽明确的说明书优良的试剂外观2.性能指标评价（根据国家卫生部颁发的试剂盒质量检定标准）准确度精密度干扰线性范围稳定性反应时间曲线评价前校正仪器、量器，严格控制实验条件，由熟练的技术人员操作32稳定性试验稳定性试验是指试剂盒的不同状态在不同条件下贮存后所能保持测定准确性的性能。状态：原包装及配制的工作液，条件：室温、冰箱温度，最终指标：有效期（一般指标为试剂空白和高值样本吸光度的变化范围等）。33第四节参考范围和医学决定水平参考范围34临床生化检验项目的结果的临床意义正常还是异常，是否及如何给予医疗措施，疗效如何等医学决定水平临界值：确定病情、判断疗效和预后项目参考范围区间：解释结果正常与否35一、参考范围（一）参考范围的建立（了解）建立包含内容：参考个体参考总体参考抽样组（参考样本）参考值参考分布参考值范围参考值区间等36(所有参考值剔除离群值并补充数据后在95％的分布范围)（参考范围）37建立的注意事项：①参考抽样组人数一般为100例以上；②离群值的判断与处理；③项目偏高、偏低均属异常的为双侧参考值区间，项目只偏低或只偏高属异常的则取单侧参考值区间，正态：x－1.65s或x＋1.65s；偏态：P5或P95的参考限；④参考值范围、参考值区间、参考范围；⑤参考范围并非一成不变的，不能机械地进行比较。38（二）参考范围概念的正确使用正常值”、“正常值范围”、“正常范围（不合理）参考范围（IFCC推荐）“正常范围”等使用不合理的原因在于：①“正常”是相对的。②是正常的人被判为“不正常”。③不正常的人被纳入“正常”。39二、医学决定水平概念：是指临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。MDL，DL（或用XC表示）可以用来除外或确定某一临床情况或预告将会出现的某一生理变化现象。图2-1健康与疾病的理论分布健康人群疾病患者DL1、DL2分别为低值、高值医学决定水平，DL1左侧的数值可除外B组疾病；DL2右侧的数值可确定患者存在B组疾病；DL1与DL2之间则表明健康与疾病存在交叉参考范围40特点：不同指标的ＭＤＬ的数量和数值不同41血清清蛋白（Alb）有三个DL，分别是20g/L、35g/L、52g/L。其中20g/L表示肝病患者的预后严重；35g/L为检查低清蛋白血症的界值；52g/L则稍高于参考范围上限，可除外许多假阳性。医学决定水平举例：血清钙有三个DL，分别是1.75mmol/L、2.75mmol/L、3.38mmol/L。1.75mmol/L作为低血钙抽搐的第一个决定性水平值，等于或低于1.75mmol/L时，应加做其他检查以明确病人发生抽搐的可能性，并采取预防措施；2.75mmol/L作为观察副甲状腺功能是否亢进的血清钙低限值，等于或高于该值时，应加做其他检查以确诊或排除原发性副甲亢的诊断；若大于3.38mmol/L则考虑为高血钙昏迷，应及时做出诊断，不得延误42第五节实验方法与参考物质概述实验方法（测量方法）测量程序下一级方法下一级测量程序常规样品产生定值