新生儿筛查试验室技术规范

新生儿筛查实验室技术规范合肥市妇幼保健所李辉新生儿疾病筛查实验室检测技术规范•本规范适用于承担新生儿苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症等遗传代谢性、先天性内分泌疾病实验室检测的医疗保健机构。•一、基本要求•（一）机构要求•1、取得《医疗机构执业许可证》的医疗保健机构。•2、获得省、自治区、直辖市卫生行政部门审查批准、取得《母婴保健技术服务执业许可证》的医疗保健机构。•3、年筛查量达3万人以上。•（二）人员要求•1、业务负责人：全日制医学及相关学校本科以上学历，高级职称，具有儿科或临床检验10年以上工作经验，从事新生儿疾病筛查工作5年以上，并熟悉或掌握新生儿疾病筛查网络运作和管理。•2、实验室技术人员：中专以上学历，从事检验工作两年以上，具有技师或以上职称，接受过新生儿疾病筛查相关实验室知识和技能培训，包括：•（1）新生儿疾病筛查的目的、原则、方法及网络运行；•（2）滤纸干血片采集、保存、处理的相关知识；•（3）标记免疫检测技术的基本知识和技能操作；•（4）新生儿疾病筛查结果的定量和定性判断；•（5）实验室质量控制的基本技能；•（6）消毒隔离技术。•3、文案人员：熟练掌握计算机操作（文字处理及统计）技术且有档案管理的工作经验。（三）设备要求（另附图）（四）房屋要求•1、实验室用房2间，共计使用面积至少40平方米以上；•2、综合用房1间，至少15平方米以上，用于滤纸干血片的验收、计算机录入和资料登记保存；•3、血片储藏室或冰库一间，用于滤纸干血片的长期保存。•二、实施原则及职责•1、收到标本应在24小时内登记，不符合要求的标本应立即退回重新采集；•2、采用国家推荐的实验方法进行滤纸干血片检测；•3、必须参加全国新生儿疾病筛查实验室间能力验证计划，及时上报测定结果，并对回报结果进行分析；•4、统计分析筛查技术服务的有关信息，包括筛查量、确诊阳性数和治疗数，定期向省、市卫生行政部门报告；•5、发现漏检病例，需寻找原因，立即向卫生行政部门报告；•6、提供可疑阳性病例的确诊和阳性病人治疗转诊联系服务；•7、必须建立以下实验室规章制度：•（1）人员分工责任制度；•（2）各种技术操作常规；•（3）质量控制管理制度；•（4）仪器管理及校准制度；•（5）试剂材料管理制度；•（6）标本登记保存制度；•（7）消毒隔离制度。•8、实验室检测结果登记和资料保存，包括：•（1）不符合要求退回的血片标本的信息，应注明原因及日期。•（2）每次检测结果的原始资料，包括标准曲线、质控结果、筛查结果。•（3）有关质量控制资料，包括室内质控图、实验室间能力比对检验结果反馈、失控原因、纠正方法等。•（4）可疑阳性追踪随访记录。•三、检测方法•采用国家推荐的实验方法和批准的标准试剂盒。对于2次实验结果均大于阳性切值的，需追踪确诊。•（一）苯丙酮尿症•1、以苯丙氨酸（Phe）作为筛查指标；•2、Phe浓度阳性切值根据实验室及试剂盒而定，一般大于120μmol/L（大于2mg/dl）；•3、推荐方法为细菌抑制法、定量酶法和荧光分析法。•（二）先天性甲状腺功能减低症•1、以促甲状腺素（TSH）作为筛查指标；•2、TSH浓度的阳性切值根据实验室及试剂盒而定，一般为10μIU/ml-20μIU/ml间；•3、推荐方法为酶联免疫吸附法（ELISA）、酶免疫荧光分析法（EFIA）和时间分辨免疫荧光分析法（Tr-FIA）。•四、质量控制•1、检测机构须在接到标本5个工作日内进行检测，并出具可疑阳性报告。•2、每月向血片采集机构反馈实验室检测结果。•3、定期参加全国新生儿疾病筛查实验室间能力比对检验，成绩合格。•4、滤纸干血片标本必须保存在2-8℃条件下至少5年，以备复查。•5、备有完整的实验室检测信息资料，存档保留至少10年。•6、结合卫生部指定质量控制中心定期公布的各种试剂灵敏度和特异性的标准，对实验室的筛查方法和结果进行评估和调整。标记免疫检测技术的基本知识和技能操作方法学的发展：时间分辨荧光免疫分析技术原理：时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluoroim-munoassay,TrFIA)是用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞。当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应，靶细胞和效应细胞的杀伤反应等发生后，核酸探针杂交反应，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。固相抗体+待测抗原固相抗体-抗原结合物+标记抗体（Eu3+等）固相抗体-抗原-（Eu）标记抗体+增强液测量荧光强度双位点抗体夹心法原理特点：1、灵敏度高、特异性强、操作简便，不用放射性物质而用镧系元素作标记物，因此具有无放射性污染、标记物制备简便、标记物稳定、便于长期保存、实验重复性好、分析速度快（1份/S）、样品用量少以及标准曲线量程宽等优点。2、镧系元素有15种，属于三价元素。在紫外光的激发下可发射离子荧光的元素有钐（Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，铽(Tb)。在TrFIA中Eu3+的应用最为广泛，而Sm3+可作为第二种选择以进行双标技术。Eu3+的复合物以310~350nm激发光激发，在增强剂的作用下，其最高荧光发射峰可达590~613nm，荧光衰变时间也长达50~1000us；而蛋白质的自然本底荧光约1~10ns，两者的差异如此之大，因此可利用时间迟缓装置延迟测量时间，待短半衰期的自然本底荧光完全衰变后测量，所测得信号就完全是镧系元素的信号，从而消除了非特异干扰的影响，提高了测定的灵敏度。3、标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素•镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种–钐（Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，锝(Te)•镧系元素荧光重要特点：–极长的荧光衰退时间•铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns–200nm的Stokes位移•铕：激发光340nm，发射光613nm•荧光素的Stokes位移为28nm–狭窄的发射峰–解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使本底达到0利用镧系元素的荧光特点，激发后以固定时间检测荧光，在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0通过波长分辨，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，零本底的又一保障发射光与激发光波长间巨大的斯托克斯位移是镧系元素荧光的重要特征之一新生儿疾病筛查结果的定量和定性判断预计值和结果说明:1、阴阳性的测定以临界值为基础。临界值用来区分推断阴性和推断阳性结果。疑似区间用来反映测试的模糊范围。试验结果会随采血时婴儿的年龄和其他条件而变化。请注意试剂盒给出的数值（临界值）只应作为参考，每个实验室都有必要建立自己的参考范围和临界值。苯丙酮尿症的定量和定性(试剂盒提供)预计值、结果血液中的PKUmg/dlumol/L推断阴性（正常）2.1127疑似区间（原血片复查)2.1-3.0127-182推断阳性（召回确诊）3.0182促甲状腺激素的定量和定性（*针对TSH阴阳性而不是CH)预计值、结果uU/mL全血uU/mL血清推断阴性（正常）920疑似区间（原血片复查）9-1820-40推断阳性（召回确诊）18402、结果处理与反馈阳性结果原血片复查正常异常阳性报告分析判断阴性报告重新采血复查正常异常确诊实验正常治疗定期复查1.超出预设的截断值(切值）即视为初筛阳性，实验室应对原血片复查。2.对于两次实验结果均为阳性的，应立即电话召回患儿重新采样或做确诊实验。新生儿疾病筛查中心消毒隔离制度•工作人员上班应衣帽整洁，不佩带耳环、戒指等首饰，不画浓装，穿工作服不得进食堂、厕所及走出单位大门。•诊治、护理、实验操作前后均应洗手，无菌操作时要严格遵守无菌操作规程。•工作用房应定时通风换气，空气消毒，坚持每天一次小扫除、每周一次大扫除的卫生制度。•病人使用的注射器、采血针等，严格实行一人一针一管一用一消毒制度，最好使用一次性用品。•使用消毒液时，应注意消毒液浓度和有效时间，严禁使用不合浓度要求或失效的消毒液。档案管理实验室检测结果和资料保存完整，内容包括：1、不符合要求退回的血片标本信息，应注明原因及日期2、每次检测结果的原始资料，包括标准曲线、质控结果，筛查结果。3、有关质量控制的资料，包括室内质控图，实验室间质量评价结果反馈、失控原因、纠正方法等若为电子版本，则需备份。筛查实验室的职责筛查实验结果是发现阳性患儿的唯一指征，因此筛查实验室的质量保障是整个质控环节的重中之重。新生儿疾病筛查实验室需要检验样本的质量、进行实验操作、分析实验结果、保证结果准确以及对样本进行储存管理，工作环节众多且容易出现差错。需要一套规范且实用的工作制度，来保证实验室的正常运作。《新生儿疾病筛查实验室检测技术规范》《医疗机构临床实验室管理办法》《临床实验室定量测定室内质量控制工作指南》《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189）新生儿筛查实验室需遵循的法规筛查实验管理–实验室设备、试剂主要设备（加样器、时间分辨荧光分析仪、洗板仪）应有专人负责，建立使用、维护、维修等SOP程序文件及记录；1.设备应标明使用状态（正常使用、维修、停用等）。2.维修和维护的设备必须经校准、检定（验证）或检测满足要求后方能再次投入使用3.维护中发现问题，实验室应检查和评估由于上述缺陷对以前所进行的检测工作的影响加样器、温度计、时间分辨荧光分析仪等应有实验室内校准程序，并有明显的标识表明其校准状态。如有国家法定计量的（如天平、压力表、加样器等）应按规定送标准计量局检定。打孔器应确保所打血斑圆整无毛边，如发现室内质控异常或发生毛边应及时更换。筛查实验管理–实验室设备、试剂应保存时间分辨荧光分析仪、加样器、洗板仪等设备的档案，档案内容应包括：1.设备的名称2.制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；3.接收日期和启用日期;4.目前放置地点；5.接收时的状态（例如全新的、经改装的）；6.仪器使用说明书的复印件；7.校准和/或检定（验证）的日期和结果以及下次校准和/或检定（验证）的日期；8.迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；损坏、故障、改装或修理的历史筛查实验管理–实验室设备、试剂试剂选择和使用：筛查实验室应当按照卫生部规定的临床检验项目和临床检验方法开展临床检验工作.不得使用卫生部公布的停止临床应用的临床检验项目和临床检验方法开展筛查工作。选择试剂需有国家SFDA产品注册证，应从有正式经营体外诊断试剂资格并有良好售后服务能力公司采购。筛查实验室所采用的试剂和设备应进行方法学评价后方能使用，指标包括分析性能（如分析灵敏度、测定准确性、精密度、稳定性、抗干扰性、检测范围等），临床性能（如临床灵敏度、临床特异性、阳性预测值等），并有质量保证措施。试剂必须在经过匹配验证的设备上使用。试剂标准量值具有可溯源性，以增加实验结果的可比性和一致性。应建立试剂请购、登记入库、领发、保管、清点盘存、报废等程序。做好试剂的质量管理和记录，建立登记本。每逢重大节假日前，进行大检查，清理过期试剂。筛查实验管理–实验室设备、试剂临床性能评价：筛查阳性率=A+BA+B+C+DAA+C临床灵敏度（检出率）临床特异性阳性预测值（OAPR）DB+DAA+B===临床确诊患儿正常试剂检测阳性AB阴性CD筛查实验管理–实验室设备、试剂分析性能评价：1.分析灵敏度：按试剂盒说明书操作规程进行测定，对最低标准品点重复测定30次，按均值±2SD进行估算2.分析特异性：选取有干扰可能的因素（如TSH试剂盒应分别选用HCG、FSH、LH等）高浓度的样本进行评价3.准确性：选取具有溯源性标准物质或质控品重复测量20次以上，其均值应与靶值接近4.精密度：对近似截断值浓度样本按试剂盒说明书操作规程进行测定，同时应考虑批内和批间的差异5.稳定性试验：将试剂盒放置37℃温度下1周后，再评价其分析灵敏度、分析特异性、准确性和精密度。6.检测范围：选择