分子生物学基础知识

聚合酶链式反应PCR（生物学的聚合酶链反应）一般指聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的TaqDNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。真核生物的启动子由于真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNApol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。(一)Ⅱ类基因的启动子和调控区Ⅱ类基因的启动子由核心元件和上游元件组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）。亚克隆（英语：subcloning）是一种分子生物学技术。亚克隆：(subclone)分为细胞克隆和分子克隆。该技术旨在将目的基因导入目标载体中，以进行进一步研究。值得注意的是，亚克隆和分子克隆（molecularcloning）不是同一概念。在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。在分子克隆中，从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆。亚克隆就是初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，将目的基因所对应的一小段DNA找出来。对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。亚克隆技术：限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。首先，使用限制酶将目的基因切下。切下来的目的基因需经过纯化（常用手法是凝胶分离法）。之后，可以通过PCR来制造一定数量的该目的基因的拷贝。同时，需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体，以让载体产生与目的基因互补的黏性末端，以使得它们能在后续步骤中被DNA连接酶连接。磷酸酯酶（通常是小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP））在该过程中也必不可少，因为它能防止载体的自身黏合。之后，再对目标载体进行分离/纯化。接下来，将目的基因与载体混合，并添加DNA连接酶。通常，目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1[1]（也有文献认为应为3比1[2]）。目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。另外，目的基因也不应过长。超过10kb（千碱基对）的话，目的基因将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚促卵泡激素糖蛋白激素，α多肽识别其他数据基因座11p13促卵泡激素（英语：follicle-stimulatinghormone,FSH，亦称为卵泡刺激素）是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程。促卵泡激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。结构促卵泡激素是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两条多肽组成。黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素采用了与促卵泡激素相似的结构。它们共享同样的α亚基（含92位氨基酸残基），而β亚基则随激素的不同而不同。促卵泡激素的β亚基含有118位氨基酸残基，负责与促卵泡激素受体的相互作用。促卵泡激素表面的糖基化涉及海藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、以及硅铝酸。其中，硅铝酸与促卵泡激素的生物半衰期紧密相关。促卵泡激素的半衰期为3至4小时。促卵泡激素的分子量约为30000Da。基因促卵泡激素α亚基的基因位于染色体6p21.1-23，在多种不同细胞中有表达；β亚基的基因位于染色体11p13，在脑垂体细胞中表达，受促性腺激素释放激素的控制，被抑制素所抑制，被激活素所增强。活性促卵泡激素调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程，特别是刺激生殖细胞的成熟。在女性体内在卵巢中，促卵泡激素刺激尚未成熟的卵泡的生长，直至成熟为格拉夫卵泡。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断促卵泡激素的进一步合成。这一机制保证了排卵的选择性。在黄体化阶段的末尾，促卵泡激素水平也有小幅度提升，可能与下一个排卵周期的开始有关。在男性体内[编辑]在睾丸中，促卵泡激素提高塞尔托利氏细胞合成男性激素结合蛋白的水平，诱发塞尔托利细胞的紧密结合，同时分泌抑制素，在成精子过程中起到至关重要的作用。作用机理[编辑]促卵泡激素的目标细胞表面表达有促卵泡激素受体，属于G蛋白偶联受体家族。促卵泡激素与其受体蛋白的结合将导致后者的构象变化。作为跨细胞膜的膜蛋白，促卵泡激素受体胞外的变构将引发胞内的变构，改变其与G蛋白的结合状态，并通过其它蛋白的参与，进一步诱发环磷酸腺苷等第二信使的生成，将信号传至细胞核内，实现对蛋白表达和细胞发育进程的调节。相关疾病[编辑]促卵泡激素水平在儿童期较低，而在女性的更年期之后则很高。高促卵泡激素水平[编辑]促卵泡激素的高水平预示着性腺引发的限制性反馈(负反馈)缺失，导致脑垂体不断合成促卵泡激素。这在女性接近或处于更年期时属于正常现象，但对于处于生育年龄的女性则是不正常的，可能是以下疾病的信号：过早绝经也称为卵巢早衰性腺障碍或Turner综合征阉割斯外尔综合征先天肾上腺增生的某些病例睾丸失效低促卵泡激素水平[编辑]促卵泡激素分泌水平的降低将导致性腺功能的缺失。在男性精子数量不足的病症中尤为典型。在女性中表现为生育周期的停止，具体相关的疾病有:多卵囊巢综合征，可能的体征有肥胖，多毛，不育等等；考曼综合征下丘脑抑制症垂体机能减退症泌乳激素过多症性腺功能低下症正在接受性腺抑制治疗使用促性腺激素释放激素结抗剂使用促性腺激素释放激素促进剂（负调节）医疗应用[编辑]促卵泡激素可在绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达得到。临床用于对不育症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟，同时也用于体外人工受精和体内人工受精的相关治疗中。促卵泡激素受体FSHR基因位于人的2号染色体上p21区，长约2080个核苷酸调控序列（英语：Regulatorysequence，又译调节序列）是DNA中一段包含启动子、增强子，以及其他可与调节蛋白，如转录因子结合的位置。这些序列调控了基因的表现，进而影响蛋白质的生产。除此之外，mRNA也有调控序列，可与RNA结合蛋白或其他RNA结合DNaseI，即DeoxyribonucleaseI，脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNaseI水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNaseI活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNaseI可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。特点：不含RNase(RNasefree)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于DNaseI失活所需的EDTA。用途：制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7,T3,SP6等RNAPolymerases催化的RNA转录后去除DNA模板；DNaseIfootprinting研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nicktranslatioin)；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。来源：从牛胰腺纯化得到。分子量：约32kDa(单体)。活性定义：37℃10分钟内，将能够完全降解1μgpBR322质粒DNA所需的酶量定义为1个活性单位。活性检测条件：40mMTris-HCl(pH8.0)，10mMMgSO4，1mMCaCl2，1μgofpBR322DNA。纯度：不含其它DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。酶储存溶液：50mMTris-acetate(pH7.5)，10mMCaCl2，50%(v/v)glycerol。ReactionBuffer(10X)：100mMTris-HCl(pH7.5at25℃)，25mMMgCl2，1mMCaCl2。失活或抑制：加入EDTA至终浓度为2.5mM后，65℃加热10分钟可使DNaseI失活。酚氯仿抽提也可以使DNaseI失活。金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNaseI有显著抑制作用。塞尔托利氏细胞会分泌以下的物质：抗苗勒管激素（AMH）——于胎儿生命的早期就开始分泌。抑制素及活化素——于青春期后分泌，配合调节促滤泡成熟激素（FSH）的分泌。雄激素结合蛋白——促进精子生成及精子成熟。胶质源性神经营养因子（GDNF）——证实是助长精原细胞，以确保精细胞在产期时的自我更新。Ets相关分子——滋养在成人睾丸精原细胞内的精细胞。转铁蛋白[1]结构[编辑]塞尔托利氏细胞之间的连接形成了血睾屏障，血睾屏障是一个结构分隔睾丸空隙血液区及精细管内的向管腔区。塞尔托利氏细胞控制养份、激素及其他化合物进出睾丸的细管，且令向管腔区成为高度免疫的位点。它亦负责确立及维持精原细胞的干细胞利基，以确保精子的更新及精原细胞在精子生成的过程中逐步分裂为成熟的生殖细胞，而最终为放出精子。其他在精子生成的成熟阶段，塞尔托利氏细胞会消耗精子没有用的部分。产生细胞一旦塞尔托利氏细胞完全分裂，就不能再增生。所以，一旦启动精子生成，就不会创造更多的塞尔托利氏细胞。一些科学家最近发现在身体以外仍能培育这些细胞。这提供了治疗男性不育缺憾的可能性。命名塞尔托利氏细胞是由发现这种细胞的意大利生理学家塞尔托利（EnricoSertoli），他是在意大利帕维亚大学研究医药时发现的。[2]他是于1862年在研究医药时用显微镜发现这种细胞。他于1865年发表这种细胞的描述，并以“像树的细胞”或“黏性细胞”来形容它。于1888年，其他科学家以他的名字来称呼这些细胞。组织学标准的染色法，是很容易将塞尔托利氏细胞与其他生殖上皮细胞混淆。而它最大的分别就是它那深色的细胞核。[3]老鼠睾丸细管的横切面病理学支持间质细胞瘤是属于卵巢瘤的性腺基质癌精子发生维基百科，自由的百科全书生精小管与成熟精子（苏木精-伊红染色）精子发生（英语：spermatogenesis）是有性生殖的雄性动物的睾丸中，生殖细胞从精原细胞一直发育到成熟的精子的过程。细胞类型倍性/染色体数量（人类）DNA拷贝/染色单体数量（人类）Processenteredbycell精原细胞(typesAd,ApandB)倍性(2N)/462C/46spermatocytogenesis（有丝分裂）prim