基因工程的基本工具

第一章基因工程海淀实验中学张可文红色荧光蛋白红色荧光蛋白基因基因表达把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或让它获得新的遗传性状，定向改造生物的新技术。目的基因转基因生物概念：“剪刀”“运载体”“针线”DNA20世纪50年代，相继有两个实验室在研究噬菌体宿主范围时发现：噬菌体寄生于天然宿主A品系的大肠杆菌将噬菌体转移于B品系大肠杆菌时不能繁殖A品系大肠杆菌B品系大肠杆菌•1962年，arber发现，噬菌体DNA在B品系中，DNA被切割成片段（降解）•1968年，两位科学家从B品系大肠杆菌中发现一种酶----可识别特定的脱氧核苷酸序列，并切割外源DNA分子。•推测这种酶对于大肠杆菌有何作用？限制性内切酶对抗外来DNA细菌细胞病毒病毒DNA限制性内切酶病毒注入DNA分子限制性内切酶切割入侵的DNA切割细菌的自我保护系统限制性内切酶DNA片断DNA磷酸二酯键氢键BamHIGGATCCCCTAGGEcoRIGAATTCCTTAAGAAGCTTTTCGAAHindIIINotISacIGAGCTCCTCGAGSalIGTCGACCAGCTGXbaITCTAGAAGATCTApaIGGGCCCCCCGGG部分限制性内切酶识别序列SmaIAluIAGCTTCGACCCGGGGGGCCC^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^限制酶名称限制酶名称识别序列识别序列回文序列GCGGCCGCCGCCGGCGBamHⅠGGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTG平末端黏性末端回文序列：一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致+GTCCAGGACCTG+GCCTAGGATCCG（EcoRI）AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAADNAABCDDNAHindⅢ切割位点出现概率：1/46各种型号“剪刀”限制性内切酶1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。迄今已从近300种微生物中分离出了约4000种限制酶。DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键下列片断在DNA连接酶的作用下能连接起来吗？•平末端与平末端•平末端与粘性末端•粘性末端与粘性末端√×不一定，相同的粘性末端可以连接？目的基因受体细胞运载体问：运载体具备什么特点才能完成此操作？基因很难进入受体细胞中，即使进入也不能进行复制和表达运载体的特点1：能进入并在宿主细胞内稳定保存并大量复制；自然界生物可以将自身的遗传物质注入其他生物体内，并进行复制表达？常用的运载体：质粒、病毒细菌的质粒：自主复制的双链、闭合、环状DNA分子；可以在细胞间转移？重组质粒DNA连接酶受体细胞运载体的特点2：有限制酶酶切位点相同限制酶……CTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAG目的基因目的基因所在片段运载体PStⅠDNA连接酶重组DNA运载体自连目的基因自连CTTAAGCTTAAGCTTAACTTAAGGPStⅠ运载体的特点3：有标记基因pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活标记基因进行筛选限制性内切酶识别序列外源基因连接PStⅠPStⅠ自主复制操作