大肠菌群计数操作规程

目的：食品中大肠菌群的计数。范围：本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。责任人：QC。内容：术语及定义1大肠菌群(coliforms)在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2最可能数mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均质器。3.6振荡器。3.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。大肠菌群计数操作规程起草：日期：审核：日期：文件编码ZL/SOP/00202批准：日期：变更原因执行日期复审日期复审状况修订发放部门：质量部3.8无菌锥形瓶、培养皿、菌落计数器。3.9pH计或pH比色管或精密pH试纸。4培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。4.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。4.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。4.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。4.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7第一法大肠菌群MPN计数法5检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。48h±2h36℃±1℃48h±2h36℃±1℃查看MPN表报告结果产气大肠菌群阳性大肠菌群阴性不产气检样25g(ml)+225ml稀释液，均质选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管10倍系列稀释BGLB肉汤不产气产气6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第二法大肠菌群平板计数法7检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2检样25g(ml)+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA计数典型和可疑菌落BGLB肉汤报告结果36℃±1℃18h-24h8操作步骤8.1样品的稀释按6.1进行。8.2平板计数8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.3平板菌落数的选择选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。8.4证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）附录AA.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌绿水溶液13.3mL蒸馏水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。A.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15g～18g蒸馏水1000mLpH7.4±0.17A.3.2制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷却至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.4磷酸盐缓冲液A.4.1成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水500mLpH7.2A.4.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.5无菌生理盐水A.5.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mLA.5.2制法称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.61mol/LNaOHA.6.1成分NaOH40.0g蒸馏水1000mLA.6.2制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.71mol/LHClA.7.1成分HCl90mL蒸馏水1000mLA.7.2制法移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。