质粒转化大肠杆菌

实验26质粒转化大肠杆菌该实验主要有两个用途：1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）原理本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备一．器材天平、秤量匙、秤量皿加热磁力搅拌器、搅拌子可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5mlEppendorf管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸42℃恒温水浴4℃和-70℃冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）37℃培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径10cm）二．试剂LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl5g加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5MNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000ml。高压15lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。含有琼脂的培养基即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。抗生素琼脂平板待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存。pH试纸（或pH计）三．实验材料来源于实验一的重组质粒受感态大肠杆菌碎冰及碎冰保温盛器实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。细菌50ulDNA5ul轻轻混匀，静置冰上30分钟。于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ulLB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。实验结果转化成功，培养皿中可见散在的菌落。转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。实验27阳性单菌落扩增与小量DNA制备目的1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。排除自身环化。鉴定方法主要有：（1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。（2）Southernblot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southernblot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。（3）酶切鉴定法及其利弊。2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。原理挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。实验准备一．器材Falcon2070管台式Eppendorf管离心机可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5mlEppendorf管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸4℃和－20℃冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至37℃，240rpm）台式4℃Eppendorf管离心机离心真空干燥器37℃水浴二．试剂含抗生素的LB培养液TE（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0）100％预冷乙醇75％预冷乙醇RNase（10mg/ml）3MNaAC溶液I50mM葡萄糖25mMTris.Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）在10lbf/in2（6.895*104pa）高压灭菌15分钟，贮存于4℃。溶液II0.2NNaOH1％SDS溶液III5M乙酸钾300ml冰乙酸58ml水142ml存于4℃。消毒过的双蒸水三．实验材料含阳性菌落的培养皿碎冰及碎冰保温盛器实验步骤1．第一天（通常为下午）从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Falcon管内的5mlLB培养液（含氨卞青霉素）中。放入37℃恒温摇床，225-250rpm剧烈摇晃培养过夜（O/N）。2．第二天（通常上午开始）（1）吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱。（2）弃上清，加入100ul溶液I，盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上，划15下），充分浮悬细胞沉淀，置-20℃冰箱内5分钟。（3）自冰箱中取出试管，加入200ul溶液II，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟。（4）加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，放于冰上15分钟。（5）放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟，将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱5分钟。（6）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。（7）加入300ulTE和2ulRNase，重浮悬沉淀，放试管于37℃的水浴中温育30分钟。（8）加入3MNaAC34ul，混匀，加入1ml预冷的100％乙醇，-20℃存放5分钟。（9）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，弃去上清。（10）加入1ml预冷的75％乙醇，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心10分钟，弃去上清。（11）旋转真空干燥10分钟。于冰上，溶解沉淀于20ul水中。实验结果通常可获得3~5ugDNA。