ChIP实验的原理与实践

一、原理转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转录是必需的，但不是充分的，通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平，ChIP主要用于研究转录因子（个人认为主要是特异转录因子的作用，因为这些因子的表达才有时空特异性）与下游基因的结合，如果ChIP发现转录因子能与目的基因结合，那么这说明该基因可能是其下游基因，要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。二、目的基因的筛选1，如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了，理论上芯片会分析出样本中该转录因子所有的下游基因，我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。2、如果是做普通的ChIP，那么在实验前要进行初步的筛选，选择自己感兴趣的目的基因，设计PCR引物，进行验证，所以，这样考虑的话，ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为，筛选目的基因的方法有一下几种：a，查文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能相关。b，你的课题设计中涉及到的基因，比如说你课题中设计到c-myb基因，你就想看一下转录因子和c-myb的关系（这个纯属碰运气）。c，根据自己早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因。3、另外筛选完自己感兴趣的基因后，可以用一些分析工具进行初步的预测，这个网上也可以搜到，就不罗嗦了，如果有战友需要，可以再讨论。三、实验设计这里只说说实验各组的作用1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）2、阳性对照：一般用anti-RNAPolymeraseII抗体，因为RNAPolymeraseII是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带3、阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阳性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，个人认为这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和目的基因组相比），也是不妨碍的。4、实验组，这个就不多说了就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因四、引物设计1、ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况，因此引物设计要选择目的基因启动子区，ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段（或者为了保险些选在2000bp），因为一般情况下，转录因子结合在这个区域，当然也有结合在更上游，或者有的文献报道在转录起始位点下游也有结合，我们就不能一一考虑这些有点特殊的情况了，我实验的时候选择的是转录起始位点上游2000bp的片段2、引物设计原则跟普通的引物相同，但是，超声后DNA被打断，所以PCR产物要尽量短一些，100多bp就足够了，因为产物长度越长，这段DNA被打断的可能性就越大，P出来的可能性就越小五、固定与超声个人认为虽然固定和超声只是样本的准备，但这步是实验成功的关键，也是出来漂亮结果的关键。不同的仪器，超声的条件差别很大，所以不能单纯的按照说明书来做，要根据自己的仪器，摸索适当的条件，另外，个人感觉超声时样本的体积不宜过大，体积过大超声容易不均匀，效果不理想，400ul左右就完全可以（这个跟超声仪探头的直径也有关系）六、ChIP这是实验的主体部分，说明书对这些步骤说的已经够详细了，为了得到理想的结果，抗体孵育时间和抗体的用量，可以适当调节，减少非特异，并最大程度的ChIP出目的基因。来源:丁香园