Western-Blot-protocol实验步骤

WesternBlotprotocol主要试剂及缓冲液的配制1).30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。2).10%SDS：称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。3).10x蛋白电泳缓冲液：30.2gTris、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml4).20×转膜缓冲液：Tris29g，Glycine144g，SDS2g加水定容至1000ml配制1×转膜缓冲液200ml(甲醇40ml，20×transferbuffer10ml，H2O150ml)5).1.5MTris8.8：（注意温度对trisPH值的影响）18.15gTris溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值8.8，定容至100ml。高温灭菌后室温保存。6).1MTris6.8：12.11gTris溶于80ml超纯水，加浓盐酸调PH值6.8，定容至100ml。高温灭菌后室温保存。7).10×PBS：NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4.12H2O35.85g，KH2PO42.4g，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000ml8).1xPBST(0.05%Tween20)：10×PBS100ml，H2O900ml，Tween2050ul9).10%（W/V）过硫酸铵：临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml超纯水，4度冰箱保存3天10).丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)：，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯水38ml11).封闭液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于1XPBST中，使用时现配。12)Strippingbuffer(BME800ul，SDS2g，TRIS0.756g，HCl调pH至6.7，加水定容至100ml)操作步骤1.蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。弃培基，用5mlPBS清洗一遍，加入1mlPBS用细胞刮将细胞挂下，移入2mlEP管中，（将平板对光观察，可以判断细胞刮下的完全度），可以用1mlPBS清洗一遍，将清洗液一并转入2mlEP管中。4000rmp离心1分钟。弃上清，以100ulPBS重悬沉淀，加入100ul2×loadingbuffer。将EP管置于金属浴中99℃处理10min（热处理管盖会崩开，在管盖上压一个重物）。置于冰上准备上样，或是-20度保存。按照之前的蛋白定量结果，10cm平板大约能提取450-600ug蛋白。2.配胶和上样电泳1).配胶前先将玻璃板、梳子和电泳仪等洗干净，并将玻璃板晾干。2).根据所检测蛋白的大小并参照表1选择丙烯酰胺的浓度，再根据表2配方配制分离胶。配制分离胶时要混合均匀并缓慢加入玻璃板里，注意分离胶与加样孔底间要留出1cm左右积层胶，用异丙醇封胶面。表1丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD)1512-431016-687.536-94557-212表2（一块胶的用量）胶浓度试剂分离胶积层胶8%10%12%15%5%ddH2O2.271.931.61.11.4030%PAGE1.331.672.02.50.33Tris.HCl1.3（1.5Mtris8.8）0.25（1Mtris6.8）10%SDS0.050.0210%AP0.050.02TEMED0.0050.002总体积5ml2ml待分离胶凝后（约需15-30min，根据室内温度），倒掉ddH2O后，用滤纸条吸干水分。参照表2配制积层胶，到积层胶时尽量倒满（如果有些漏要及时补胶），插梳子前保证梳子的清洁。拔梳前，需要用刀片沿梳和玻板间隙划一次以除去玻璃板外的胶。待积层胶凝固后拔掉梳子，这时，若发现有上样孔歪斜，可以用注射器针头将上样孔调整好，之后将胶版装上电泳槽后，加上电泳缓冲液后待用，清洗时避免槽间隔异位。3).样品上样：蛋白样品临上样前，13000rpm、1分钟高速离心，上样时取上清。80V电压跑浓缩胶，120V跑分离胶。参考marker条带，到相应位置时停止电泳。上样品左右两边如果有空余泳道，可加等体积的1×上样缓冲液，这样跑出来的胶好看。2.转膜（半干转，整个操作中戴手套，不要用手触膜）①在电泳过程中，剪好与分离胶等大的滤纸10张和PVDF膜1张（国产电泳仪分离胶大小约为8.5cm×5.5cm）；配transferbuffer(20ml5×transferbuffer，20ml甲醇，加水至100ml)；先在容器中加入适量甲醇，放入PVDF膜（可切角帮助标记正反面），浸泡30s-1min后转移到转膜液中待用。然后将PVDF膜和滤纸每五张一起叠放整齐并在transferbuffer中浸透（保证中间无气泡）。②打开电转仪，碳板要擦洗干净，可减低背景。在准备转膜的部位倒少量transferbuffer，把浸透的五张滤纸从中间慢慢覆盖到碳板上，并用少量transferbuffer湿润。电泳结束后，小心地将两块玻璃板分开，注意不能使胶有破损或变形，在胶的中间部分倒少量transferbuffer，将PVDF膜从中间慢慢覆盖到胶上（这样不容易产生气泡）。然后将边缘多余的胶（包括积层胶）切去，在预先放好的五张滤纸上再倒少量transferbuffer，然后膜在下、胶在上，放置在五张滤纸上。然后再在胶上倒少量transferbuffer，将另五张浸透的滤纸慢慢地从中间覆盖到胶上（滤纸、胶和膜的放置顺序如下图），如同时转两张膜，则可在第一块胶上铺十张滤纸，后再加第二块膜、胶和五张滤纸，操作同上。盖上转膜仪盖子，设置时间等，开始转膜，12V、48min。上滤纸5张胶PVDF膜滤纸5张下3.丽春红染色：（初学者建议保留这一步，熟练后这一步可省略）转膜结束后，取出PVDF膜，用甲醇浸泡后待甲醇挥发干、用铅笔标记出marker的位置。水洗一下，丽春红染色5min以确认蛋白是否有效地从胶转移到了膜上（丽春红可以与膜上的所有蛋白结合、但不会干扰特异蛋白随后与抗体的反应，而氨基黑与蛋白的结合则不可逆。也可以将胶用考马斯亮蓝染色，看胶上的蛋白是否已经完全转到了膜上)。染色5min后水洗1-2次至出现较清晰的条带，拍照留存。拍照后可用水洗膜，直至红色消失。封闭：配5ml1×PBS(PBST)+0.25g脱脂奶粉的封闭液，待丽春红染色后，用水漂洗膜后，再用1×PBST漂洗。封闭：TBST淋湿转膜下来的PVDF膜，摇床上封闭液室温封闭1h。5.一抗孵育用PBST（封闭液）稀释一抗（PBS需要高压灭菌。抗体稀释倍数按照抗体说明书，一般abgent公司的一抗1:1000稀释后用来做ＷＢ），待封闭完成后，用PBST漂洗两次。孵育抗体，具体步骤如下：在培养板的板盖上铺一张大小适中的封口膜，将抗体滴加在封口膜的一端，镊子取出PVDF膜，在吸水纸上停留一会，之后正面向下，PVDF膜一端接触抗体后，慢慢盖向另一端。注意不能有气泡。之后再向膜上加少许抗体液。盖上盖子，水平置于4℃冰箱中，孵育过夜。一抗可回收，重复使用，一般3-5天内效果无妨。6.二抗孵育按1:2000的比例稀释二抗（羊抗鼠或是羊抗兔）。先于摇床上PBST洗膜3次，每次10分钟。用相同的方法孵育二抗）。抗体弃去后洗膜，摇床上PBST洗膜3次，每次10分钟（按照往常经验，需继续清洗2-3次，或者TBST中静置1小时，可降低背景）。7.显影：Thermo公司Supersignal试剂，A、B等体积混匀在试管中，，锡箔包裹。滴在PVDF膜上，GE公司Las4000mini显影拍照。先怕暗视野再拍白光。