5-DNA-replication-mutation-injury-and-repair-2

第一节DNA的复制一、DNA复制的一般特征二、原核生物的DNA复制三、真核生物DNA复制四、线粒体DNA复制五、噬菌体和病毒DNA的复制第四章DNA的复制、突变、损伤和修复（一）单链环状DNA的复制过程单链环状DNA以滚环复制方式进行，如大肠杆菌噬菌体ΦX174、M13、G等。现以ΦX174为例说明。1.第一阶段：单链环状DNA以亲本链（正链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合的环状复制型（RF1）。RF1合成的引发首先由单链结合蛋白（SSB）结合到单链环上。基因FTTTATAA.TA.TA.TA.TA.TG.CG.CG.CG.CG.CA.TAGGAC.GC.GC.GC.GA.TA.T5’TGATAAAAGATTCACTCTCACCTTATA.TGA.TTTTCTGCTTAGGAGTTTAATCATCTTTCAGACTTT3’ACAGG.CG.CG.CA.TAAG.CG.CGⅡⅠ基因GΦX174pas发夹结构在F和G基因之间有一个不完整的回文结构（palindromes），形成两个发夹结构，此部分不与SSB结合。此结构称为passite，即引发体组装位点（primosomeassemblysite），此结构与五种蛋白（priA，priB，DnaT，DnaB，DnaC）结合形成引发体。2.第二阶段：通过成环滚环复制（loopingrollingreplication）产生多个子代复制型（RF）。首先，由噬菌体A基因编码的A蛋白（gpA）识别并结合到环状双螺旋DNA正链的复制原点，打开一个缺口，产生复制型Ⅱ（RFⅡ），然后gpA的酪氨酸残基与5’端核苷酸共价连接，保留磷酸二酯键打开释放的能量，接着，gpA，DNA螺旋酶和SSB共同参与DNA双螺旋解旋，形成复制叉。gpA使打开的正链5’端形成环（loop），由大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅲ以“－”链为模板，在打开的正链3’端合成一条不断循环的的正链，即为“滚环复制”（rollingcirclereplication）。（二）线状DNA的复制过程1.双链线状DNA复制起始线状DNA复制起始有两种类型：一种是从DNA中间开始，如T7，另一种是从末端起始如腺病毒。①T7噬菌体的复制起始：T7有39936bp，41个基因。有三个启动子PI、PⅡ、PⅢ，其中PⅡ起复制作用。T7的复制起始区位于基因1和基因1.1之间。T7DNA两端有“末端冗余”，还有一个基因4产物的识别位点3’CTGGG5’。T7复制起始必需三个酶：T7RNA聚合酶，T7DNA聚合酶，基因4蛋白（geneproduct4，gp4）。T7RNA聚合酶（gp1）是基因1产物，是基因1.1直到最末尾的基因转录所不可缺少的。基因4产物是多功能酶：1.一是依赖单链DNA的核苷-5’-三磷酸酯酶活性（dTTP酶活性最高），2.二是螺旋酶活性，3.三是引发酶活性。T7DNA聚合酶由两个亚基组成：一个是T7的基因5蛋白（gp5），分子量为84kDa，单独存在时具有单链DNA3’→5’外切酶活性和进行下很低的聚合酶活性，聚合酶在催化1-50个脱氧核苷酸参入后即与模板脱离。另一个亚基是噬菌体诱导出来的寄主基因trxA编码的硫氧还蛋白（thioredoxin），分子量为12kDa。两个亚基结合后（1：1）成为具有很高进行性的DNA聚合酶，还具有单链、双链DNA的3’→5’外切酶活性。②腺病毒复制的起始腺病毒DNA为线性双链，长度约3.6万bp。每个腺病毒DNA在5’末端都共价连接了一个55kDa的蛋白质，称末端蛋白质（terminalprotein），简称TP。TP以丝氨酸羟基通过磷酸二酯键与5’端的胞嘧啶共价连接。腺病毒两端有反向末端重复序列，长度介于103-162bp。1.在两末端各有50bp的区域为其两个复制点2.其中一个C-G碱基对和第9-18碱基对完全保守3.核因子NF1的结合位点也高度保守4.头25bp中有一段富含AT的区域，序列中AT占80%。保守序列NF1结合位点TP–CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAG…置换链3’GTAGTAGTTATTATATGGAATAAAACCTAACTTCGGTTATACTATTACTC…模板链腺病毒复制原点的序列起始过程：①首先由寄主蛋白质-核因子NF1与DNA结合；②在72KDa的腺病毒单链DNA结合蛋白（DBP）和ATP共同存在下由TP催化使末端解链；③140KDa的腺病毒DNA聚合酶催化80KDa的TP前体蛋白8（pTP）中的丝氨酸残基与dCTP5’磷酸形成磷酸二酯键，反应除去一分子焦磷酸，形成pTP与dCMP的连接物；④C与模板3’端的G以氢键相结合形成起始复合物。dCMP游离的3’-OH为DNA聚合酶延伸反应提供了引物复制起始复合体引发复制（不需引物）避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMPCG●过程SSB+ATPDNA末端解链TPpTP-Ser+dCTPpTP-Ser-dCMP3’OH2.线性DNA复制的终止：线性DNA复制完成后，面临一个很严重的问题即当5’端引物切除，因没有3’-OH的存在，无法将缺少的一段补起来。这称5’末端隐缩。T7噬菌体如何解决这一问题。T7噬菌体DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸称为末端冗余（terminalredundancy），两个子代分子中的单链末端可以互补。多余的单链部分可以被DNAase切去，然后再由DNA连接酶连接起来。1992年JD.Walson提出了串联体假说。??二聚体3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHT7噬菌体的末端复制专一性核酸内切酶3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′互补的3′端配对3′5′3′5′PolI和连接酶封闭缺口3′5′3′5′3′5′5′3′限制性酶交错切割3′5′3′5′3′5′3′5′PolI3‘端延伸完成复制3.单链线状DNA的复制啮齿动物中的一种微小病毒（parvovirus），其基因组是一条单链线状DNA。微小病毒一般含有4800bp，只编码三个蛋白。转录和复制所需的蛋白和酶系统都利用宿主细胞。微小病毒单链DNA的两端具有不同的反向重复顺序，可形成发夹结构。RepCapITRITRssDNA;invertedterminalrepeats(ITR);RepgenerequiredforDNAreplication;Capgeneencodescapsidproteins(-)3’5’abcda’b’feghf’e’abcda’b’5’3’efghf’e’e’f’g’h’fea’b’c’d’ba(-)(-)(+)(+)(-)3’5’5’3’abcdb’a’efghf’e’e’f’g’h’fe(-)(+)abcda’b’5’3’efghf’e’e’f’g’h’fe(-)(+)abcdb’a’e’f’g’h’fe(+)feghf’e’(-)(-)(+)(三）逆转录病毒1.逆转录病毒的复制：逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒有三个基因：gag-编码核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码被膜糖蛋白。1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53’方向合成DNA，底物为四种dNTP,并要求短链RNA作引物。逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：①RNA指导的DNA聚合酶活性；②DNA指导的DNA聚合酶活性；③核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用；④无校对功能，错误率高，易产生变异。逆转录过程a)tRNA与PBS结合，反转录合成部分DNA负链b)RNase降解病毒RNA5’末端c)第一次跳跃d)负链DNA继续合成e)RNA被降解，U3左边留下片段作引物合成部分正链DNAf)第二次跳跃－－正链DNA与负链的另一端结合g)完成正链合成LTR末端2.逆转录病毒与疾病：大多数逆转录病毒造成的疾病都是比较慢性的，有些病毒虽然不直接导致疾病，但可以导致癌症，有些病毒可以在其基因插入细胞基因内而不导致疾病。在人类进化的过程中有许多逆转录病毒将它们的基因插入人的基因内并成为人的基因的一部分。癌基因（oncogene）又叫转化基因（transforminggene）是人类或其他动物基因组中含有的一类基因。细胞癌基因（cellularoncogene，c-onc）原癌基因（proto-oncogene），未活化的c-onc。病毒癌基因（virusoncogene，v-onc）HIV病毒-引起艾滋病的病原体。人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。普遍认为，人类免疫缺陷病毒的感染导致艾滋病（AIDS,AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，“爱滋病”），艾滋病是后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重机会感染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病。自1983年发现（LucMontagnier；RobertGallo），HIV全球夺命2500万，死亡人数超过第一次世界大战，目前艾滋病病毒感染者尚有3300万人。HIV结构及生活史周期3.HIV与药物①核苷类似物：1985年发现几种核苷类似物（nucleosideanalgues）能竞争性抑制HIV-1逆转录酶活性，并在逆转录中终止cDNA链的延伸。如3’-叠氮脱氧胸苷（azidothymidine,AZT)，1987年FDA批准上市的第一个治疗艾滋病有效药物。本品经细胞中酶的作用转化成活性型三磷酸齐多夫定，后者竞争性抑制HIV的逆转录酶，抑制其DNA的合成、运送和整合至宿主细胞核，而抑制病毒复制。类似的还有双脱氧肌苷/胞苷（DDI/DDC）②非核苷类似物：Nevirapine和Pyridinone两者均可直接抑制HIV-1逆转录酶，对AZT耐药株有效；对HIV-2无作用，易产生耐药性。③HIV-1蛋白酶的抑制剂第二节基因突变一、突变概念和类型（一）突变概念：突变(mutation)是指遗传物质发生的可遗传的变异。没有发生突变的基因称为野生型(wildtype)基因。自然发生的突变称自发突变（spontaneousmutation）。物理或化学因素引起的突变称为诱发突变（inducedmutation）；这些因素叫做诱变剂（mutagen）；由于突变剂的作用而产生突变的过程或作用称为突变生成作用（mutagenesis）。带有突变位点的基因称为突变基因（mutantgene）；带有突变基因的生物个体或群体称为突变体（mutant）。第四章DNA的复制、突变、损伤和修复（二）突变类型：根据突变的原因和结果，可从多方面、多角度对基因突变进行分类。1.碱基置换突变（basesubstitutionmutation）；由于碱基对的置换或者一个或多个碱基的增加或减少而引起的基因突变。根据DNA碱基序列的不同改变又可分为点突变、碱基插入、碱基缺失等。①点突变：通常指碱基替代，点突变又可分为：单点突变（pointmutation）和多点突变（multiplemutation）。可以分为转换（transitions）和颠换（transversions）两类。转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。②碱基插入（baseinseration）：通常指较长的碱基序列增