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第五届中国病毒性肝炎与艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛—161—determiningserumHBVmarkers.ClinChimActa,2006,372:129-133.[13]谭璐.化学发光微粒子免疫分析法与酶联免疫法测定乙肝标志物的比较.实用学杂志,2008,15:294-295.[14]郭洪,张学英,郭丽娟.i2000化学发光分析仪检测乙型肝炎病毒标志物的应用.中华医院感染学杂志,2011,21:1276-1277.[15]杨凡,单咏梅,周宏,等.不同方法学检测乙型肝炎血清标志物结果的评价分析.检验医学,2010,25:732-724.[16]ShijiWu,YanlingLiu,LimingCheng,etal.ClinicalEvaluationoftheSignal-to-CutoffRatiosofHepatitisCVirusAntibodyScreeningTestsUsedinChina.JournalofMedicalVirology.JournalofMedicalVirology,2011,83:1930-1937.[17]JingP,LimingC,YinBT,etal.DevelopmentofaneconomicandefficientstrategytodetectHBsAg:Applicationof“gray-zones”inELISAandcombineduseofseveraldetectionassays.ClinicaChimicaActa,2011,412:2046-2051.[18]高志峰,胡丽华,雒维.两种方法检测患者血清中丙肝抗体的对比分析.临床血液学杂志,2011,24:456-457.[19]汤巧,吴文静,夏永祥.化学发光法和酶联免疫吸附法检测丙型肝炎病毒抗体的比较分析.国际检验医学杂志,2011,6:834-835.[20]PoppC,KramsD,BeckertC,etal.HBsAgbloodscreeninganddiagnosis:performanceevaluationoftheARCHITECTHBsAgqualitativeandARCHITECTHBsAgqualitativeconfirmatoryassays.DiagnMicrobiolInfectDis,2011,70:479-485.[21]PfeiferK,PelzerC,ColemanP,etal.EarlydetectionofhepatitisBsurfaceantigen--prototypeofanewfullyautomatedHBsAgmicroparticleenzymeimmunoassay(MEIA).ClinLab,2003,49:161-166.[22]SonneveldMJ,RijckborstV,BoucherCA,etal.AcomparisonoftwoassaysforquantificationofHepatitisBsurfaceAntigeninpatientswithchronichepatitisB.JClinVirol,2011,51:175-178.[23]LouSC,PearceSK,LukaszewskaTX,etal.AnimprovedAbbottARCHITECTassayforthedetectionofhepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg).JClinVirol,2011,51:59-63.乙肝病毒检测技术及应用的研究进展宋利琼李金明作者单位:100730北京协和医学院研究生院,中国医学科学院(宋利琼);卫生部北京医院,卫生部临床检验中心(李金明)通信作者:李金明,电子信箱:ljm63hn@yahoo.com.cn乙型病毒性肝炎是我国疾病负担昀重的传染病。1992年全国血清流行病学调查人群乙肝病毒感染率达60%,表面抗原携带率为9.75%,全国乙肝病毒携带者约为1.2亿人[1]。乙肝病毒感染后昀大的危害是导致慢性病毒携带,部分演变为慢性肝炎、肝硬化、肝腹水甚至癌变,其中新生儿90%乙肝病毒携带者,儿童约30%乙肝病毒携带者,成年人约10%乙肝病毒携带者,会转化为慢性乙肝。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因组长约第五届中国病毒性肝炎与艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛—162—3.2kb,为部分双链环状DNA。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF),即S、C、X和P,分别编码HBV表面抗原、核心/e抗原、X蛋白以及HBVDNA多聚酶[1]。一、快速检测许多情况下,需要对乙肝病毒时行快速检测。乙肝病毒的快速检测一般采用的是胶体金免疫层析技术,其原理为:用胶体金颗粒标记抗体(或抗原),与标本中的待检抗原(或抗体)特异性结合,结合物在液体毛细作用下泳动,至包埋有特异性配体的检测线位置时,这些标记有胶体金颗粒的抗原抗体复合物配体被拦截聚集,从而显示出肉眼可见的颜色[2]。胶体金免疫层析技术试剂稳定,标本用量少,数分钟即可完成检测,肉眼可判反应结果。能够在较为简陋的环境下快速报告结果,但是灵敏度相对弱一些。乙肝属于血源筛查项目,目前献血现场对献血人员进行初筛时,一般通过胶体金法对血液中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)进行快速检测。二、血清学标志检测HBV血清学标志包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM,目前常采用酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、微粒子酶免分析法(MEIA)或化学发光法等检测。1.ELISA:是目前应用昀为广泛的免疫学检测方法,既可以利用抗体来检测抗原,也可以利用抗原来检测抗体,这种测定方法有三个要素:(1)固相的抗原或抗体;(2)酶标记的抗原或抗体;(3)酶反应底物。常用于乙肝病毒检测的ELISA主要有以下几种类型:双抗体夹心法检测乙肝病毒表面抗原和e抗原;间接法检测特异性乙肝病毒表面抗体(IgG)、e抗体(IgG)和核心抗体(IgG);捕获法检测乙肝病毒核心抗体(IgM)。ELISA方法操作简单,3~4个小时即可获得检测结果,不需要昂贵的仪器,适合于大批量检测,灵敏度和特异性较好。但ELISA方法通过酶催化底物的显色反应放大检测信号,其对信号的放大作用有限,有文献报道ELISA检测HBsAg为阴性的血液用聚合酶链反应可检出HBVDNA,体内仍有HBV复制[3];同时ELISA检测结果易受许多因素影响,如标本中抗原浓度太高可能导致假阴性;血清中非特异性IgG浓度过高或含有类风湿因子,或固相包被的抗原纯度不够,则可能导致假阳性结果。ELISA灵敏度一般认为在ng/ml水平[4]。2.固相放射免疫法(solid-phaseradioimmuno-assay,SPRIA):是利用放射性同位素标记已知抗原或抗体,使其与待测的相应抗体或抗原结合,洗去未结合部分,昀后用计数器测定放射性强度,从而推算出受检的抗原或抗体含量。SPRIA灵敏度高,检测生物活性物质可达Pg水平,比ELISA的灵敏度高20倍[3]。徐群清等分别采用SPRIA与ELISA两种方法对886名在校大学生进行HBV血清标志物检测,结果显示SPRIA法检测HBsAg的敏感性、准确性和阳性符合率分别为96%、99.4%和98.9%,而ELISA法检测HBsAg的敏感性、准确性和阳性符合率分别为87.7%、98.1%和95.8%[5]。但由于同位素稳定性差、对环境会造成放射性污染等原因,SPRIA已很少用于乙型肝炎标志物的检测。3.微粒子酶免分析法(microparticleenzymeimmunoassay,MEIA):有三个主要技术特点:第一点,将抗原或抗体包被到微粒上,而不是包被在微孔板上,这样包被的抗原(或抗体)可与样本充分混合,从而大大增加了反应面积,提高了反应速度;第二点,结合有抗原抗体复合物的微粒可与玻璃纤维不可逆性结合,通过真空抽干,实现液想和固相的迅速分离。第三点,MEIA采用测定荧光信号初速度的方法代替测定终点荧光信号强度的方法,不仅缩短了检测时间,更重要的是荧光信号初速度与标本中抗体(或抗原)浓度具有很好的线性关系,大大提高了定量检测的准确性。雅培公司的AxSYM系统便是采用这种方法。彭仕芳等对1140例乙型肝炎患者血清HBV标志物用MEIA和ELISA两第五届中国病毒性肝炎与艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛—163—种方法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBc和抗-HBe四项指标[6],结果显示MEIA法检测的阳性率分别为94.00%、46.75%、97.96%和61.41%,而ELISA法检测的阳性率分别为91.89%、36.14%、93.26%和18.11%,即MEIA法检测各指标的阳性率均高于ELISA法,其中两种方法检测的HBeAg和抗-HBe的阳性率差异有高度显著性(P<0.01)。与MEIA法比较,ELISA法检HBsAg的相对灵敏度为97.46%,抗-HBc为94.93%,HBeAg为73.41%,抗-HBe为41.73%,因此认为MEIA法对血清HBV标志物的检出阳性率高于ELISA法,特别是对HBeAg和抗-HBe指标的检测。4.时间分辨荧光免疫分析法(Timed-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA):出现于20世纪80年代,采用稀土元素铕代替普通的荧光素标记,从而具有许多特点:铕的半衰期是普通的荧光素的1000倍,通过延迟检测荧光信号,大大提高信噪比;铕的激发光谱范围宽,发射光谱却非常窄(10nm);铕稳定而且没有放射性。这些特点使其检测灵敏度可达到放射免疫的水平,但确不受放射性核素的使用限制。成为昀有发展前途的非放射免疫标记技术[7-10]。目前中山达安的TRFIA法乙肝血清标志物5项检测试剂盒均已获得国家食品和药品监督管理局批准。三、病毒载量检测慢性乙型病毒性肝炎的治疗以抗病毒治疗为关键。2007年美国肝脏病研究学会(AASLD)制定的乙型肝炎治疗指南,主要根据ALT水平和HBV载量来决定是否给予治疗:ALT>2倍正常值上限(upperlimitsofnormal,UIN)、HBVDNA>2×104U/ml的慢性乙型肝炎患者。无论其e抗原状态都需要治疗。我国各医院的乙墅肝炎抗病毒治疗也大多遵循类似标准[11]。目前乙肝病毒载量的检测主要有两种方法:PCR-ELISA方法和实时荧光定量PCR方法。1.PCR-ELISA方法:以罗氏的COBASAMPLICOR为代表,在实时荧光PCR方法还未广泛应用之前,COBASAMPLICOR是HBVDNA定量检测的金标准,也曾是美国FDA惟一批准的PCR检测系统,该系统利用荧光标记的特异性单克隆抗体定量检测HBVDNA的PCR产物,并将标本处理、PCR扩增、ELISA检测三个过程实现一体化。2.实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术:昀早由美国AppliedBiosystems公司于1996年推出,通过荧光染料或荧光探针实时监测PCR扩增过程,大大提高了检测灵敏度和特异度。普通PCR定量是通过终末扩增产物对初始模板进行定量,终末扩增产物波动性很大,这使得这种定量方法具有很大的不确定性,实时荧光PCR方法引入CT值概念,即PCR扩增从基线期进入指数期所经离的循环数,CT值与初始模板的对数值之间具有非常好的线性关系,这使得PCR定量检测方法发生质的飞跃。其中以TaqMan探针为基础的real-timePCR方法因为技术开放,引入探针增强了检测特异性,应用昀为广泛。目前实时荧光PCR方法渐成为乙肝病毒载量检测的主要方法,柯华、达安均提供HBVDNA定量检测产品,罗氏新推出的COBASTAQMAN,便是采用实时荧光PCR技术的DNA定量检测的自动化平台。四、基因分型1988年Okamoto首先提出了乙型肝炎病毒基因分型法.随着分子生物学技术的发展,基因分型的方法也在不断进步,渐趋简化、准确[12]。根据HBV全基因
本文标题:乙肝病毒检测技术及应用的研究进展
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