沙门氏菌实验13.37-附件

1华南农业大学答辩委员会主席XXX评阅人XXX摘要沙门氏菌是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原结构相似的革兰氏阴性菌。其种类繁多，少数能使人致病，其他可使动物致病，偶尔可传染给人。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门氏菌属肠道细菌科，主要引起人类伤寒、副伤寒以及食品中毒或败血病。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食品中毒常占首位或者第二位。据称在所有肉用动物中,家禽显然对沙门氏菌最易感受。沙门氏菌易于在雏鸡肠道内定居与增殖，鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌是引起鸡常见多发性传染病的细菌，严重影响雏鸡成活率，造成成年鸡产蛋等生产性能的下降[2]。所以在实脸上和生产实践上必须及时进行家禽肠道传染病的预防及控制。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。随着DNA和抗体技术的发展，近20年间出现了很多改进的方法，其中许多方法可以在48h内检出沙门氏菌。根据GB/T4789.4-2008，食品中沙门氏菌传统的检测方法有5个基本步骤：前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化试验、血清学分型鉴定。目前检测食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。本实验由于实际条件的限制，取10g鸡肠作为样品按照国标方法进行沙门氏菌检测。关键词：沙门氏菌革兰氏阴性食物中毒2目录前言.............................................................................................................31材料与方法.....................................................................................................31.1材料...........................................................................................................31.1.1仪器....................................................................................................31.1.2试剂...................................................................................................41.2实验步骤..................................................................................................51.2.1前增菌...............................................................................................61.2.2增菌...................................................................................................71.2.3分离...................................................................................................71.2.4生化试验...........................................................................................71.2.5血清学鉴定.......................................................................................92结果与分析....................................................................................................102.1初步判断结果........................................................................................1032.2生化实验初步鉴别结果.........................................................................102.3补做ONPG实验结果...............................................................................112.4血清学鉴定结果.....................................................................................112.5结果报告................................................................................................113讨论...............................................................................................................12前言沙门氏菌病的病原体。属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。己发现的近一千种(或菌株)。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和副伤寒乙杆菌引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。家禽、蛋和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病。1材料与方法1.1材料1.1.1仪器冰箱：2℃～5℃。恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。4均质器。振荡器。电子天平：感量0.1g。无菌锥形瓶:容量500mL，250mL。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）无菌培养皿：直径90mm。无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。pH计或pH比色管或精密pH试纸。全自动微生物生化鉴定系统。1.1.2试剂缓冲蛋白胨水（BPW）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液亚硫酸铋（BS）琼脂HE琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂沙门氏菌属显色培养基三糖铁（TSI）琼脂蛋白胨水、靛基质试剂尿素琼脂（pH7.2）氰化钾（KCN）培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基糖发酵管邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基半固体琼脂丙二酸钠培养基沙门氏菌O和H诊断血清。生化鉴定试剂盒。51.2实验步骤操作如下图161.2.1前增菌称取10g（mL）鸡肠放入盛有90mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。于36℃±1℃培养8h～18h。71.2.2增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。1.2.3分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和HE琼脂平板。HE琼脂平板于36℃±1℃培养18h～24h，BS琼脂平板于36℃±1℃培养40h～48h，观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1表1沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或黑色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色1.2.4生化试验1.2.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至4h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2沙门氏菌属在三铁糖琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果8三塘铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢——+++++++（—）+（—）+（—）+/—+（—）+（—）+（—）+/—+—+—可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属非沙门氏菌属注：+阳性；—阴性；+（—）多数阳性，少数阴性；+/—阳性或阴性表2说明，在三铁糖琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。注：TSI结果判定方法：斜面黄色为+，红色为—；底层黄色为+，红色为—；产气可以观察培养基内的气孔；硫化氢的判断是培养基转黑色为+，黄色为—。入试管底部全部为黑色，可以判断底层为+。赖氨酸脱羧酶试验管为蓝绿色，对照管变黄为阳性；试验管和对照管均变黄色为阴性。1.2.4.2通过TSI反应中的H2S、靛基质实验、尿素琼脂、KCN实验结果，查表3将可以反应分为A1、A2、A3。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢(H2S)靛基质pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注:+阳性；-阴性；+/-阳性或阴性注：靛基质试验在培养后加靛基质试剂2-3滴，立即观察，表面为红色为9阳性，不变色为阴性，尿素试验结果为桃红色为阳性，淡橙红色为阴性；氰化钾浑浊，有菌生长为阳性，反之阴性。1.2.4.3反应系列号A1:典型反应判断为沙门氏菌属.如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有一项异常，按表4可判断为沙门氏菌属。如2项异常为非沙门氏菌属。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶判定结果---甲型副伤寒沙门氏菌属(要求血清学鉴定结果)-++沙门氏菌IV或V(要求符合本群生化特征)+-+沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注:+阳性:-阴性1.2.4.4反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。甘露醇和山梨醇试验结果为黄色是阳性，紫色是阴性。1.2.4.5反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。ONPG试验结果为深黄色是阳性,谈黄色或无色是阴性。1.2.4.6API20E生化鉴定试剂盒如选择API20E生化鉴定试剂盒，可根据表2的初步判定结果，从营养琼脂平板上挑取可以菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，试用API生化鉴定试剂盒进行鉴定.1.2.5血清学鉴定1.2.5.1抗原的准备一般采用1.2%-1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。本次试验采用扩大培养营养琼脂平皿上的菌落做实验。101.2.5.2多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出两个约1cm*2cm的区域,挑取