单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图：单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月）准备抗原动物免疫选择免疫动物Elisa测抗血清分离脾细胞骨髓瘤细胞细胞融合（融合剂:PEJ）HAT培养基筛选杂交瘤细胞筛选阳性细胞（三天内做完流式）阳性克隆并扩大培养细胞冻存扩大培养收集上清动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存1、抗原提纯与动物免疫：选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3～4只小鼠，间隔一般2～3周，末次免疫后3～4天，分离脾细胞。2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞3、细胞融合将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间4、有限稀释法筛选阳性株筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。5、单克隆抗体的制备与保存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法