第三章-基因芯片的制作方法

第三章基因芯片的制作方法3.1概述1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年项目原位合成法直接点样法探针预备不需要需要探针类型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因组DNA，蛋白等探针长度约25nt不限制联合合成需要不需要芯片表面点样不需要需要密度高低制作成本高低应用基因表达，突变检测基因表达，突变检测，CGH1.常见的载体类型膜玻片三维基质包被玻片3.2芯片载体的制作（1）膜优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。（2）玻片优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。（3）三维基质包被玻片具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。2.玻片的修饰类型氨基修饰玻片同型双功能偶联剂修饰的玻片硫醇基修饰的玻片环氧硅烷化修饰的玻片等图3-3APS修饰玻璃表面反应示意（1）氨基修饰的玻片羟基氨基对苯乙异硫氰酸（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片异硫氰基醛基戊二醛连接分子手臂分子特异性探针图3-7SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）连接硫醇基修饰的玻片硫醇基图3-8环氧硅烷化玻片修饰示意（4）环氧硅烷化修饰的玻片环氧硅烷基1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）4.RNA探针3.3探针的制备cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的。通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特异性探针探针分子与基片表面的作用方式化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。3.4点样仪及点样过程接触式点样非接触式点样1.接触式点样点样针。基本过程：点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象，使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样品在基片上留下斑点，完成一次点样。点样针的种类：实心针（solidpin）裂隙针（splitpin）毛细管针（capillarytube）针与环（pinandring）best2.非接触式点样（自学）（1）微螺线阀（2）压电元件接触式非接触式压电元件微螺线阀11图3-10当前59家芯片设备生产商使用的点样针分布情况（图中的数字代表使用各点样针的厂家数目）3.5原位合成法操作平台Affymetrix芯片的特点：光导原位合成的寡核苷酸芯片高密度的点阵技术独特的PM-MM探针设计1.光导原位合成原理2.高密度的点阵技术1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”)3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计图3-11PM-MM探针设计方案高灵敏度图3-12仅用PM探针与联合应用PM-MM探针检测靶序列的灵敏度比较芯片结果准确可靠图3-13PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较4.光导原位合成法的缺点1.需要避光掩膜，造价高；2.光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的提高3.对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的一部分，探针浪费严重