考马斯亮蓝R-250及G-250染料

1考马斯亮蓝R-250及G-250染料考马斯亮兰G-250；名称：考马斯亮兰G-250别名：考马斯亮兰G250，酸性蓝90，考马斯亮蓝G，康美赛蓝G-250，亮蓝G英文：COOMASSIEBRILLIANTBLUEG-250CAS：6104-58-1相对分子量：854.04分子结构：性状：暗蓝-紫-棕色结晶粉末。水中溶解度：40g/L（20℃），溶于甲醇、乙醇；介绍及用途：考马斯亮兰G-250用于凝胶电泳和蛋白质染色。不用渗透到胶里就比萘酚蓝黑B1（NaphtholBlueBlackB1）灵敏度高3倍，简单而又灵敏；可以进行各种蛋白检测，和劳里反应相牵连的化学物质和游离氨基酸对此蛋白染色检测无任何影响。也是P2X7嘌呤能受体激动剂。考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。2此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。2.器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1.标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G―250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2.微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。考马斯亮蓝R-250；31名称：考马斯亮蓝R-250别名：亮蓝R；考马斯亮蓝R；考马斯灿烂蓝；康美赛蓝R-250；英文：COOMASSIEBRILLIANTBLUER-250CAS：6104-59-2相对分子量：854.04分子结构：性状：暗蓝-紫-棕色结晶粉末。水中溶解度：40g/L（20℃），溶于甲醇、乙醇；介绍及用途：考马斯亮兰G-250用于凝胶电泳和蛋白质染色。不用渗透到胶里就比萘酚蓝黑B1（NaphtholBlueBlackB1）灵敏度高3倍，简单而又灵敏；可以进行各种蛋白检测，和劳里反应相牵连的化学物质和游离氨基酸对此蛋白染色检测无任何影响。也是P2X7嘌呤能受体激动剂。马斯亮蓝R-250与G-250的区别一般R250染蛋白，G250一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高，但较慢，脱色较难。G250常用的蛋白染料，作定性试验用，染色后为蓝绿色；R250较敏感,，做定量实验用，染胶效果较好，染色后为红蓝色。考马斯亮蓝R250（CoomassiebrilliantblueR250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560~590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。考马斯亮蓝G250，又名XylenebrilliantcyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。分子式C47H50N3O7S2+MW=854；λmax=590~610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。考马斯亮蓝R-250染色液配制方法组份浓度：0.1％（W/V）考马斯亮蓝R-250，25%（V/V）异丙醇，10％（V/V）冰醋酸配制量：1L配制方法：1.称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中。2.量取250mL的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。3.加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。4.加入650mL的去离子水，均匀搅拌。5.用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。考马斯亮蓝的三种染色法：考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝4胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。2．室温下振摇温育4h至过夜。3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。灵实验室前沿敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。2．室温下振摇温育20min。3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝{实验室前沿}胶结合的染料。4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。实验室前沿2．配制染色液：在500m12％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g纯化的考马斯亮蓝G—250。室温保存。3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。4．室温下振摇温育1h或更长时间。5．排干液体。摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。6．室温下振摇温育过夜。7．将染液倒回贮液瓶以备重复使用。用水或常规脱色液清洗凝胶并观察脱色效果。8．为了使胶体染料固定在蛋白质上，可再加入5倍体积的20％硫酸铵并于室温下振摇温育过夜。凝胶固定后，可重复染色增大灵敏度。从步骤5开始进行重复。灵敏度为0．05～0．1ttg蛋白／每条带。——来源：实验室前沿参考文献Syrovy,I.andHodny,Z.(1991).J.Chromatogr.569,175-196.