DB11T 819-2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范

ICS11.220B41备案号：31304-2011DB11北京市地方标准DB11/T819—2011锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范TechnicalprotocolfordiagnosisofKoiHerpesvirusDisease2011-08-09发布2011-12-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T819—2011I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。DB11/T819—20111锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范1范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、PCR检测、结果判定。本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。KHV：锦鲤疱疹病毒（Koiherpesvirus）KHVD：锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease）PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）4样品要求4.1水温采集样品时的水温应在16℃～32℃。4.2品种采样品种为锦鲤或鲤。4.3数量按照SC/T7103执行。4.4状态DB11/T819—20112采集的样品不得腐败。4.5信息采集需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。5锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特征5.1患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列临床症状：——最显著的特征为烂鳃,鳃出血并产生大量黏液,鳃丝溃烂；——体表出现苍白的块斑和水泡；鳍条和尾鳍充血；鳞片上出现血丝；——眼球凹陷；——口腔和腹部充血和出血。5.2患KHVD的锦鲤和鲤，具有下列流行病学特征：——混养池塘中,只有鲤或锦鲤（且不论大小）生病和死亡,而其它种类，如金鱼、草鱼等无此现象；——水温在18℃～30℃时,特别是在25℃～28℃时,鲤或锦鲤大量死亡,当水温升高或降低时,死亡现象下降或停止；——死亡极快，一条健康鱼从出现临床症状到死只有24h～48h；死亡率极高，疾病发生后在10天内,死亡率可达80%～100%。6PCR检测方法6.1试剂和材料6.1.1水：符合GB/T6682—2008中一级水的规格。6.1.2KHV阳性核酸片断：由农业部指定机构提供。6.1.3Taq酶：－20℃保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。6.1.4dNTP：10mmoL/L。6.1.5氯化镁溶液浓度：25mmoL/L。6.1.6扩增KHV的TK基因中的409bp片断的引物：浓度为100pmoL/μL。其序列如下：KHV-TK-F:5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’；KHV-TK-R:5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’。6.1.7扩增KHV的Sph基因中292bp片断的引物：浓度为100pmoL/μL。其序列如下：KHV-Sph-F：5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’；KHV-Sph-R：5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3’。6.1.8DEPC水：用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水。6.2器材和设备6.2.1普通冰箱和超低温冰箱。6.2.2组织研磨器。DB11/T819—201136.2.3离心机和离心管。6.2.4PCR扩增仪。6.2.5水平电泳仪。6.2.6微量移液器及吸头。6.2.7紫外观察灯或凝胶成像仪。6.3样品处理6.3.1体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾），体长大于6cm的鱼则取肾、脾、鳃；无临床症状的鱼，另外需加取肠和脑组织。6.3.2将所取样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度悬于磷酸盐缓冲液（参见附录A.1）。6.3.3将450μL悬液放入1.5mL的离心管，再加入450μLCTAB溶液（参见附录A.2）并混匀，25℃作用2小时。6.4DNA抽提在含有样品的离心管中加入600μL抽提液Ⅰ（参见附录A.3），用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL）。再加入700μL抽提液Ⅱ（参见附录A.4），用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。再加入预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，放置离心管于－20℃下，至少8h后取出。12000r/min离心30min，倒去上清液。将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。加11μLDEPC水溶解后，作为PCR模板。6.5DNA扩增6.5.1使用KHV-TK引物的反应体系为100μL：在0.2mL反应管中加入10μL模板、2.5μLdNTP、10μL氯化镁溶液、10μL10倍Taq酶缓冲液（参见附录A.5）、KHV-TK-R和KHV-TK-F各1μL、2.5UTaq酶、加DEPC水至100μL。将反应管置于PCR扩增仪。反应程序：94℃变性5min；95℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，40次循环；72℃延伸10min；4℃保温。6.5.2使用KHV-Sph引物的反应体系为100μL：在0.2mL反应管中加入10μL模板、2μLdNTP、8μL氯化镁溶液、10μL10倍Taq酶缓冲液、KHV-Sph-R和KHV-Sph-F各0.5μL、2.5UTaq酶、加DEPC水至100μL。将反应管置于PCR扩增仪。反应程序：94℃变性30s；94℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸30s，40次循环；72℃延伸7min；4℃保温。6.6设立对照6.6.1在6.3样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。6.6.2取KHV阳性核酸片断作为阳性对照。6.6.3取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。6.6.4取等体积的水代替模板作为空白对照。6.7琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液（参见附录A.6），配制1.5%的琼脂糖平板（含1μL/mLEB，参见附录A.7）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和2μL上样缓冲液（参见附录A.8），按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参考物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达底部时停止。DB11/T819—201147结果判定7.1PCR检测结果的判读即在紫外光下观察扩增带。用KHV-TK基因引物，PCR后阳性对照会出现一条409bp的DNA片段；用KHV-Sph基因引物，PCR后阳性对照会出现一条292bp的DNA片段。阴性和空白对照无上述核酸带。7.2如果被检测样品有临床症状，PCR后能够得到409bp和/或292bpDNA片段者，则可确诊为KHVD。7.3无临床症状样品，PCR后能够得到409bp和/或292bpDNA片段者，则判定样品为KHV可疑。可疑的样品可经基因测序确定是KHV后，判定为KHV阳性。7.4PCR后没有得到409bp和292bpDNA片段者，判定为KHV阴性。DB11/T819—20115附录A（资料性附录）试剂配制A.1磷酸盐缓冲液称取氯化钠（NaCl）7.9g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.8g，溶于800mL蒸馏水中，调节溶液酸碱度至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。A.2CTAB溶液按CTAB（hexadecyltrimethyammoniumbromide）2%，氯化钠（NaCl）1.4moL/L，乙二胺四乙酸（EDTA）20mmoL/L，三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）20mmoL/L配制，调节溶液酸碱度至7.5，用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。A.3抽提液Ⅰ1mmoL/L三羟基氨基甲烷饱和酚（Tris-饱和酚）、三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按25：24：1的比例混合，密闭避光保存。A.4抽提液Ⅱ三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按24：1的比例混合，密闭避光保存。A.510倍Taq酶缓冲液按三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl，酸碱度8.8）500mmoL/L，氯化钾（KCl）500mmoL/L，聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）1%配制。A.6TBE电泳缓冲液（5倍浓缩）称取三羟基氨基甲烷（Tris）54g，硼酸（HBO3）27.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9g，加水至1000mL，用稀盐酸（HCl）调节酸碱度到8.0。A.7EB（EthidiumBromide，核酸染色剂）用水配制成10mg/L的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。A.86×上样缓冲液溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入氢氧化钠1滴，调至蓝色。__________________________