gb17009-1997

【GB17009—1997】风疹诊断标准及处理原则前言风疹是由风疹病毒引起的急性呼吸道传染病，呈世界性分布，在我国归属于法定丙类传染病，一年四季均可发生，以冬春季发病为多，易感年龄以1～5岁为多，故流行多见于学龄前儿童。自风疹疫苗问世以来，发病率明显下降。风疹临床症状轻微，但孕妇妊娠早期初次感染风疹病毒后，病毒可通过血胎屏障进入胎儿，常可造成先天性胎儿畸形、死胎、早产，因此，风疹的早期确诊及预防极为重要。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由浙江医科大学传染病研究所、中国预防医学科学院病毒学研究所负责起草。本标准主要起草人：刘克洲、张礼璧。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。1范围本标准规定了风疹的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级各类医疗、保健机构、卫生防疫机构和人员对风疹病人的诊断、报告和处理。2诊断原则典型病例可根据临床表现结合流行病学作出临床诊断，不典型病例需根据血清风疹抗体的检测或风疹病毒的分离阳性予以确诊。3诊断标准3．1风疹3．1．1流行病学史与确诊的风疹患者在14～21天内有接触史。3．1．2临床症状3．1．2．1发热。3．1．2．2全身皮肤在起病1～2天内出现红色斑丘疹。3．1．2．3耳后、枕后、颈部淋巴结肿大或结膜炎或伴有关节痛（或关节炎）。3．1．3实验室诊断3．1．3．1咽拭子标本分离到风疹病毒（见附录A），或检测到风疹病毒核酸。3．1．3．21个月内未接种过风疹减毒活疫苗而在血清中查到风疹IgM抗体（见附录B）。3．1．3．3恢复期病人血清风疹IgG抗体滴度较急性期有4倍或4倍以上升高，或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳转（见附录B）。3．1．4病例分类3．1．4．1疑似病例：具备3．1．2．2条，同时伴3．1．2．1或3．1．2．3条。3．1．4．2临床诊断病例：疑似病例加3．1．1条。3．1．4．3确诊病例：疑似病例加3．1．3．1或3．1．3．2或3．1．3．3条。3．2先天性风疹综合征3．2．1临床表现3．2．1．1新生儿白内障／先天性青光眼，先天性心脏病，听力缺损，色素性视网膜病，唇裂腭裂，头小畸形，X线骨质异常。3．2．1．2紫癜、脾肿大、黄疸、精神性迟缓、脑膜脑炎。3．2．2经实验室确诊患儿母亲在妊娠早期有风疹病毒感染史3．2．3实验室诊断3．2．3．1婴儿血清风疹IgM抗体阳性。3．2．3．2婴儿风疹IgG抗体水平持续存在，并超过母体被动获得的抗体水平（4倍以上）。3．2．3．3婴儿咽拭子、血、尿、脑脊液或脏器活检标本分离到风疹病毒或检测到风疹病毒RNA。3．2．4病例分类3．2．4．1疑似病例：具备3．2．1．1任一条或可伴3．2．1．2任一条。3．2．4．2临床诊断病例：具备3．2．1．1任一条或可伴3．2．1．2任一条，同时伴3．2．2条。3．2．4．3确诊病例：临床诊断病例加3．2．3．1或3．2．3．2或3．2．3．3条。4处理原则4．1病人的隔离与治疗发现风疹疑似或诊断病例，应立即隔离，一般隔离至出疹后5天。一般接触者不进行检疫。对病人进行对症处理和支持治疗。先天性风疹综合征患儿根据病症专科治疗。确诊有风疹病毒感染的早期孕妇，为防止可能产生胎儿先天性畸形，建议及时终止妊娠。4．2预防孕妇风疹对育龄妇女，宜进行婚前或孕前检查血风疹IgG抗体，如证实为易感者，均应接种风疹疫苗。孕妇妊娠早期（3个月内）尽量避免同风疹病人接触。如一旦接触，可在潜伏期内查血清风疹IgG抗体，若阳性表明既往曾有过风疹病毒感染，若阴性应继续在接触后1个月左右再测一次血清IgG和IgM抗体，若明确阳转可判为风疹病毒感染。4．3免疫预防预防风疹有效方法是接种风疹减毒活疫苗，可对易感人群实行接种。附录A（标准的附录）病原学诊断方法A1病毒分离从病人呼吸道采集标本分离病原体。A1．1标本收集风疹病人宜在出疹前4～5天至疹后1～2天取咽拭子标本。先天性风疹综合征患儿除咽拭子标本外，亦可于出生后尽快取尿液、眼泪、脑脊液、骨髓等标本。将灭菌棉棒稍蘸液体（2％牛血清Eagle液），反复涂抹患者咽部数次，然后将棉棒浸于上述标本液（1～1．5mL）中反复挤压，标本液中加足量抗生素（青、链霉素1000u／mL）及制霉菌素50μg／mL（或二性霉素5μg／mL）。A1．2接种取0．1～0．2mL标本液接种于生长在试管中的单层原代乳兔肾细胞（PRK）（或其他原代细胞如原代人胚肾、兔胚纤维细胞、人胚二倍体细胞等）上，置37℃吸附1～2h后弃液，再加入含双倍常规抗生素量的维持液1mL，置33℃培养，每隔4天换液，连续观察8～14天。如无细胞病变可见，即置—30℃冻化3次，盲目传代。每次传代可接种于RK13、Vero、BHK21、LLC－MK2细胞上，连续盲传3代。A1．3观察细胞病变一般于10天左右出现细胞病变。若不出现病变，可在接种14天后用100TCID50的ECHO11病毒或一定量的Sindbis、或VSV、或脊髓灰质炎病毒攻击，并设正常细胞种毒对照。若对照出现病变，接种标本管无病变，表示原接种的细胞内已有病毒感染的存在。A1．4毒株鉴定用已知风疹病毒免疫血清，观察能否与新毒株起作用，传统用中和试验、血凝抑制试验或采用免疫荧光法作病毒鉴定等。A2病毒核酸检测利用分子杂交技术或PCR技术检测风疹病毒核酸。附录B（标准的附录）血清学诊断方法B1血凝抑制试验B1．1原理鹅红细胞（或鸽红细胞）上有风疹病毒受体，遇风疹病毒可产生凝集现象。若将抗体与病毒（血凝素）预先温育后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制。定量血凝素与不同稀释度抗体（血清）作用后能完全抑制血凝的昀高血清稀释度，即为血凝抑制抗体效价。B1．2主要材料B1．2．1血凝板：6×12或8×12个圆形孔（孔底光滑）的U形板。B1．2．2定量移液器：定量移液器选用25μL（即0．025mL）。B1．2．3尖底小试管：形如离心管，便于血清的吸取。B1．3风疹血凝素的制备取毒种感染BHK21细胞或Vero细胞，常规换液培养。末次换入2％牛血清199综合培养基，置33℃培养6～7天以上，待细胞病变十十十时收获，冻化，取上清液用Tween－80乙醚处理即为血凝素；如用白陶土处理的2％牛血清配制感染细胞的培养基来制备血凝素，则不用Tween－80乙醚处理。B1．4血凝滴度所用溶液一律置4℃预冷，微量塑料板法。血凝素用葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲液以12∶倍比递增稀释，再加0．25％新鲜鹅红细胞（或鸽红细胞）悬液，混匀，置4℃至少1h，观察结果，以“＋＋＋＋”（4单位）的昀高稀释度为血凝滴度。B1．5血凝抑制试验原血清0．1mL＋0．7mL氯化锰肝素液，4℃作用20min后在18∶稀释的血清中加1滴积压鹅红细胞（或鸽红细胞），1h内摇2～3次，置4℃过夜，再以2000r／min的速度离心10min，取上清液待检。待检血清用pH6．2的葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲液倍比稀释后，每孔加0．025mL血凝素（含4单位；如系pH9的血凝素，事先应用0．1mol／L盐酸调至pH6．2左右再用）。抗原抗体在4℃作用1h后加入0．25％鹅红细胞1滴（0．025mL），在4℃下作用2h后判定结果，以完全抑制血凝为终点。每次试验预设以下对照：阳性血清对照：应出现一定已知效价阴性血清对照：应出现阴性结果待检血清对照：应无非特异性凝集抗原对照：应出现＋＋＋＋＋（4单位）、＋＋＋（2单位）、＋＋～＋（1单位）、±（1／2单位）的凝集现象血球对照：应为阳性HI抗体阳性标准判定以116∶作为阳性标准。葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲剂（DGV）配制：巴比妥0．58g巴比妥钠0．38g明胶0．6g无水CaCl20．02gMgSO44·H2O0．12gNaCl8．5g葡萄糖10g巴比妥与明胶可分别先各在250mL蒸馏水中加温溶解，然后依次加入其他药品，溶解后加双蒸水至1000mL，分装10瓶消毒。用前以0．1mol／L盐酸将pH调至6．2，用于稀释待测血清、配制血凝素及红细胞。氯化锰－肝素液配制MnCl23．96g肝素16万单位加双蒸水至100mL，使用时以双蒸水稀释4倍（13∶）。B2酶联免疫吸附法检测风疹IgG抗体（ELISA间接法）B2．1原理将风疹抗原包被于固相载体上，加上待检血清，再用酶标抗抗体间接检出特异性抗体。B2．2材料B2．2．1聚苯乙烯酶标板。B2．2．2风疹阴性和阳性血清。B2．2．3风疹抗原。B2．2．4抗入IgG辣根过氧化物酶结合物。B2．2．5酶底物邻苯二胺－双氧水。B2．3操作程序B2．3．1用pH9．6碳酸盐缓冲液稀释风疹抗原与未感染风疹病毒的细胞抗原（对照抗原）。B2．3．2于40孔聚苯乙烯板的单排孔与双排孔分别加入0．1mL／孔的风疹抗原与对照抗原。右下昀后一孔不加任何抗原作为空白对照，4℃过夜。B2．3．3以0．05％Tween20生理盐水（NS－T）洗板三次，倒去洗液。B2．3．4在血凝板中以2％牛血清NS－T将待测血清稀释成1：20～1：1280四个稀释度，每个稀释度加风疹抗原与对照抗原各1孔（0．1mL，下同），轻轻振摇后置371℃～2h。B2．3．5以NS－T洗三次，倒去洗液后每孔加入以2％牛血清NS－T稀释的抗人IgG辣根过氧化物酶结合物0．1mL（空白对照不加），置371℃～2h。B2．3．6以NS－T洗三次，倒去洗液后加邻苯二胺－双氧水底物液，每孔0．1mL（包括空白对照孔），避光在37℃放置10～20min，随时观察，待对照孔开始显淡黄色时即用2mol／L硫酸终止，每孔加50μL。B2．3．7用空白对照孔调零点，以酶标仪（492nm）测定各孔OD值。OD值不足0．05者按0．05计。凡同一稀释度下风疹抗原孔OD值／对照抗原孔OD值＞2．1即P／N为阳性。阳性之昀高稀释度的倒数即为该血清的抗体效价。小于120∶者视为阴性。B2．3．8每次实验应作已知效价的阳性及阴性血清对照。B3酶联免疫吸附法检测风疹IgM抗体（抗体捕捉ELISA法）B3．1原理利用包被在固相载体上的抗人IgMμ链抗体，捕捉待检血清中的IgM，再用风疹病毒抗原和已知的酶标风疹病毒抗体去检测血清中IgM是否为抗风疹抗体。利用底物使酶显色而测知。B3．2材料B3．2．1聚苯乙烯40孔或96孔板。B3．2．2抗人IgMμ链抗体。B3．2．3风疹病毒抗原和正常对照抗原。B3．2．4抗风疹病毒抗体（单克隆或多克隆）。B3．2．5酶标抗抗体：抗风疹病毒抗体和酶标抗抗体也可用酶标抗风疹病毒抗体代替。B3．2．6酶底物－邻苯二胺及双氧水。B3．2．7已知的风疹IgM抗体阳性和阴性血清。B3．2．8包被液：0．05mol／L碳酸盐缓冲液（PH9．6）无水碳酸钠159mg碳酸氢钠293mg，使用不超过2周蒸馏水加至100mLB3．2．9洗涤液（NS－T）：0．85％盐水的吐温液氯化钠17g吐温201．0mL蒸馏水加至2000mLB3．2．10稀释液为5％牛血清的NS－T液。B3．2．11邻苯二胺－过氧化氢底物液先配柠檬酸磷酸缓冲液（PH5．0）：磷酸氢二钠18．41g柠檬酸5．1g蒸馏水加至1000mL，分小瓶冰冻保存临用时配底物液：邻苯二胺（OPD）4mg柠檬酸磷酸缓冲液10mL30％双氧水5mLB3．3操作B3．3．1包被抗人IgMμ链抗体，每孔100μL。B3．3．24℃过夜，倒掉液体，用10％牛血清NS－T液120μL封闭。B3．3．3371h℃后倒去封闭液，洗三次。B3．3．4加待测血清（1100∶稀释，即1μL待测血清加100μL稀释液），每孔100μL。每份血清加2孔（或4孔），372h℃后洗三次。B3．3．5加风疹抗原于1孔（或2孔）中，每孔100μL；另1孔（或2孔）中加正常对照抗原，4℃过夜后，洗三次。B3．3．6加风疹单克隆抗体每孔100μL，371℃．5h后倒去抗体，洗三次。B3．3．7加酶标记的抗鼠抗体，每孔100μL，371℃．5h后倒去抗鼠抗体，洗4次，扣干。B3．3．6与B3．3．7两步，亦可用加酶标抗风疹单克隆（或多克隆）抗体一步所取代，每孔加100μL，37℃水