可溶性糖的测定

实验1可溶性糖的测定一、实验目的1．学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。2．学习721型分光光度计的原理和操作方法。二、实验原理总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在150μg/ml以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用，样品不必经过水解。三、实验器材1．试管（或具塞试管）2.吸量管及试管架（1ml、10ml）3．沸水浴4.冰浴5．721型分光光度计6．蒽酮试剂称取100mg蒽酮溶于100ml98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。7．葡萄糖标准溶液（100μg/ml）200ml精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000ml。8．样品溶液200ml可自选待测物制成样品溶液。举例：称取500g市售白薯（或淀粉），洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液溜渣，将渣放于烘箱内80～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取100目筛下物为待测样品。取样品在烘箱内105℃烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80ml沸蒸馏水，放入沸水浴。不时摇动，提取0.5h。取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。冷却至室温，用蒸馏水定容至100ml。9．白薯。四、实验步骤：1．制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。编号试剂(ml)1234567葡萄糖标准液（100μg/ml）H2O蒽酮试剂01.0100.10.9100.20.8100.30.7100.40.6100.60.4100.80.210每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂1后，同时置于沸水浴中，准确加热7min，立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。然后以第2～7管溶液含糖量μg为横坐标，吸光度（OD620）为纵坐标，画出含糖量与OD620值的相关标准曲1要在冰浴条件下加入蒽酮，以防止发热，影响颜色反应。生成的颜色较稳定，在4h内无明显变化。线。2．测定样品的含糖量取4支试管按下表操作。编号试剂（ml）1234样品溶液H2O蒽酮试剂01.010.01.0010.01.0010.01.0010.0其他操作与制作标准曲线相同。将第2～4管测出的OD620平均值，根据OD620平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，再换算成100g样品中总糖的含量。五、思考题：用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么？为什么？实验2氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定Ⅰ甲醛滴定法测定氨基氮一、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：RCHNH3+COO-RCHNH3+COO-NH2+H+,是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—NH3+所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色减小于10，很难准确指示终点。常温下，甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。RCHNH3+COO-RCHCOO-NH2+H+NaOHHCHORCHCOO-NHCH2OHRCHCOO-中和N(CH2OH)2如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量2。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。三、实验器材25ml锥形瓶，3ml微量滴定管，吸管。0.1mol/L标准甘氨酸溶液：准确称取750.7mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。0.1mol/L标准氢氧化钠溶液32脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定ml数偏低。酪氨酸的滴定ml数偏高。3标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。酚酞指示剂：0.5%酚酞的50%乙醇溶液中性甲醛溶液：在50ml36～37%分析纯甲醛溶液中加入1ml0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。四、实验步骤1．取3个25ml的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入2ml0.1mol/L的标准甘氨酸溶液和5ml水，混匀。向3号瓶内加入7ml水。然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2ml甲醛溶液，再混匀。分别用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的ml数。取平均值，计算甘氨酸基氮的回收率。甘氨酸氨基氮回收率%=100加入理论量实际测得量公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。2ml乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘14.088。即为加入理论量的mg数。2．取未知浓度的甘氨酸深液2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。氨基氮（mg/ml）=式中：V未为滴定待对测液耗用标准NaOH溶液的平均ml数。V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准NaOH溶液的平均ml数。mol/LNaOH为标准NaOH溶液的真实摩尔浓度。五、思考题选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？Ⅱ氨基酸的纸层析法分离鉴定一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的实验原理及操作方法。二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：Rf=原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距在一定的条件下某种物质Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、实验器材1．层析缸42.毛细管3．喷雾器4.培养皿5．试析滤纸（新华一号）6、试剂：（1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，加入0.1%的茚三酮。取漏斗内的扩展剂约5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。（2）氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）各5ml。四、实验步骤：1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2．取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如右图。3．点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15～20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5．显色将滤纸取出，置烘箱中烘烤5min（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。6．计算各种氨基酸的Rf值。五、思考题：1．何谓纸层析法？2．何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？3．怎样制备扩展剂？4．层析缸中平衡溶剂的作用是什么？4本实验所用层析缸是用大的标本缸代替的。若用标准的层析缸，滤纸平衡后应用长颈漏斗从层析缸上部小孔中加入扩展剂。H2So4△冷却弃残渣留滤液弃上清液留RNA沉淀实验3核糖核酸的分离、组分鉴定与定量分析一、实验目的学习从酵母中分离RNA和鉴定RNA组分的方法，并用苔黑酚法测定RNA的含量。二、实验原理RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将细胞破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的粗制品。RNA在硫酸煮沸液中可水解成核糖、嘌呤硷、嘧啶硷和磷酸，可分别进行鉴定。核苷酸核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3.5——二羟基甲苯在沸水浴中加热后，有绿色复合物产生。这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成醛糖，后者再与3.5——二羟基甲苯作用产生绿色络合物。可用比色法测定绿色复合物在670nm有最大光吸收，故光吸收值与浓度成正比。三、实验器材1、器材：匀浆机、离心机、试管、烧杯、水浴锅。2、试剂：酵母、酸性乙醇、95%乙醇、碱液、FeCl3浓HCl液、苔黑酚。四、实验步骤1、酵母RNA的提取：取酵母1.0g（5片）加0.04MNaOH8ml倒入10ml塑料离心管中，离心（3000rpm）10min倾入小烧杯中缓慢加入10ml酸性乙醇转移至10ml塑料离心管中离心3min（3000rpm）研磨成匀浆倒入玻璃试管中沸水浴20min去上清液,加5ml95%乙醇（或乙醚）洗涤沉淀RNA离心3min（3000rpm）得RNA粗品。RNA+浓HCl+OHHOCH3沸水浴FeCl3鲜绿色复合物沸水浴沸水浴2、水解RNA：将沉淀RNA转移到玻璃管中+10ml1.5MH2SO43、RNA组分鉴定：①嘌呤碱：取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物的絮状沉淀。②核糖：取1ml水解液+2ml苔黑酚三氯化铁溶液10min观察颜色变化（亮绿色）③磷酸：取1ml水解液+1ml定磷试剂10min观察颜色变化（蓝色）4、RNA含量测定（1）按下表加样操作标准管样品管空白管RNA标准液0.5mlRNA样品水解液0.5ml蒸馏水0.5mlFeCl3浓HCl液2ml2ml2ml苔黑酚：0.2ml0.2ml0.2ml摇匀沸水浴10min沸水浴10min沸水浴10min取出冷却后670nm比色测定OD1OD2OD3（2）结果计算。RNA标准液为0.3mg/ml。1g酵母片提取RNA的总体积为10ml。（OD1-OD3）/（OD2-OD3）=C标/C样RNA含量（mg/g）=C样×10/w留21作鉴定用留21作定量用RNA水解液沸水浴10min实验4维生素C的定量测定一、实验目的1．学习维生素C定量测定法的原理和方法。2．进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术。二、实验原理测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2，6-二氯酚靛酚作用，其反应如下：2，6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈现蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。CCCCCOOHHOCH2OHOHOHCCCCCOOHHOCH2OHOOHOHNOClClOH++NClClOH抗坏血酸(还原型)2,6-二氯酚靛酚(氧化型)玫瑰色抗坏血酸(氧化型)2,6-二氯酚靛酚(还原型)根据上述反应，利用2，6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2，6-二氯酚靛还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入2，6-二氯酚靛酚就不再被还有原脱色而呈玫瑰色。故当样品液用2，6-二氯酚靛酚标准液滴定时，溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化，达到了滴定终点。此时，记录滴定所消耗的2，6-二氯酚靛酚标准液量，按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。计算公式：维生素Cmg数/100g样