GB 5009.222-2016 食品安全国家标准 食品中桔青霉素的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.222—2016食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.222—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.222—2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》、SN/T2426—2010《进出口粮谷中桔霉素含量检测方法液相色谱法》和SN/T2916—2011《出口食品中桔霉素的测定方法免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》。本标准与GB/T5009.222—2008相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定”;———增加了净化步骤;———增加了适用范围。GB5009.222—20161食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定1范围本标准规定了食品中桔青霉素的测定方法。本标准第一法适用于大米、玉米、辣椒、红曲类产品中桔青霉素的测定,第二法适用于大米、大麦、燕麦、小麦中桔青霉素的测定。第一法免疫亲和柱净化-高效液相色谱法2原理试样中的桔青霉素用甲醇-水提取,提取液经过滤、稀释后,用免疫亲和柱净化,采用液相色谱结合荧光检测器测定桔青霉素的含量,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.3磷酸(H3PO4):色谱纯。3.1.4冰乙酸(C2H4O2):色谱纯。3.1.5氢氧化钠(NaOH)。3.1.6吐温20(C58H114O26)。3.1.7氯化钠(NaCl)。3.1.8磷酸氢二钠(Na2HPO4)。3.1.9磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.10氯化钾(KCl)。3.2试剂配制3.2.1氢氧化钠溶液(2mol/L):称取80.0g固体氢氧化钠,溶于1L水中。3.2.2磷酸溶液(10mmol/L,pH7.5):准确移取1.376mL磷酸加水定容至2000mL,用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5。3.2.3磷酸溶液(10mmol/L,pH2.5):准确移取1.376mL磷酸加水定容至2000mL,用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至2.5。3.2.4PBS缓冲溶液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用水溶解,GB5009.222—20162调节pH至7.0,用水定容至1000mL。3.2.50.1%吐温20-PBS溶液:准确移取1mL吐温20以PBS缓冲溶液定容至1000mL。3.2.60.1%磷酸溶液:准确移取1mL磷酸加水定容至1000mL。3.2.7洗脱液Ⅰ:甲醇-10mmol/L磷酸溶液(pH2.5)(70+30)。3.2.8洗脱液Ⅱ:甲醇-0.1%磷酸溶液(70+30)。3.3标准品桔青霉素(C13H14O5,CAS号:518-75-2),纯度≥99.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备液:准确称取一定量的桔青霉素标准品,以甲醇溶解并定容至10.0mL作为标准储备液,浓度为100μg/mL,于4℃下保存。3.4.2标准中间液:准确移取1.0mL桔青霉素标准储备液于10mL容量瓶中,用甲醇定容,浓度为10μg/mL,于4℃下保存。3.4.3基质标准工作液:根据需要,取适量的标准中间液,用空白样品提取液配成不同浓度的基质标准工作液,现用现配。3.5材料3.5.1桔青霉素免疫亲和柱:柱体积3mL,最大柱容量20ng,或等效柱。3.5.2玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪,配荧光检测器。4.2分析天平:感量0.0001g和0.01g。4.3高速均质器:≥12000r/min。4.4混匀器。5分析步骤5.1提取5.1.1大米、玉米、辣椒称取经充分粉碎均质试样10.0g(精确至0.1g)于150mL具塞锥形瓶中,加入50mL甲醇-水(70+30)提取液,以高速均质器高速均质提取2min,过滤提取液,移取1.0mL滤液,置于另一干净的容器中,加入49mL10mmol/L磷酸溶液(pH7.5)稀释、混匀;以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化。5.1.2红曲及其制品称取经充分粉碎均质试样1.0g(精确至0.1g)于50mL具塞锥形瓶中,加入20mL甲醇-水(70+30)提取液,以高速均质器高速均质提取2min,过滤提取液,移取1.0mL滤液,置于另一干净的容器中,加入39mLPBS缓冲溶液稀释、混匀;以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化。GB5009.222—201635.2净化5.2.1大米、玉米、辣椒将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针筒下,准确移取10.0mL(相当于0.04g试样)上述澄清滤液过免疫亲和柱,以1滴/s~2滴/s的流速全部通过亲和柱;加入5mL10mmol/L磷酸(pH7.5)以1滴/s~2滴/s的流速淋洗柱子,直至空气进入到亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL洗脱液Ⅰ进行洗脱,洗脱流速为1滴/s~2滴/s。收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。5.2.2红曲及其制品将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针筒下,准确移取10.0mL上述澄清滤液过免疫亲和柱,以1滴/s~2滴/s的流速全部通过亲和柱;加入10mL0.1%吐温20-PBS溶液,以1滴/s~2滴/s的流速淋洗柱子,直至空气进入到亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL洗脱液Ⅱ(红曲及其制品)进行洗脱,洗脱流速为1滴/s~2滴/s。收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。5.3空白试验除不加试样外,均按上述操作步骤进行。5.4测定5.4.1液相色谱参考条件5.4.1.1大米、玉米、辣椒液相色谱分析条件列出如下:a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;b)柱温:30℃;c)流速:1.0mL/min;d)进样量:50μL;e)检测条件:激发波长350nm,发射波长500nm;f)流动相A液:乙腈,流动相B液:10mmol/L磷酸(pH2.5)。流动相及梯度洗脱条件见表1。表1流动相及梯度洗脱条件时间/min流动相A液/%流动相B液/%020801020801470301820802020805.4.1.2红曲及其制品液相色谱分析条件列出如下:a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;GB5009.222—20164b)柱温:30℃;c)流速:0.7mL/min;d)进样量:50μL;e)检测条件:激发波长350nm,发射波长500nm;f)流动相A液:乙腈,流动相B液:0.1%磷酸。流动相及梯度洗脱条件见表2。表2流动相及梯度洗脱条件时间/min流动相A液/%流动相B液/%040601406079010990101040601540605.4.2标准曲线的制作配制0.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL6个浓度的基质标准工作液。在仪器最佳工作条件下,用基质标准工作溶液分别进样,以相应的桔青霉素的色谱峰的峰面积为纵坐标,以基质标准工作溶液中桔青霉素的浓度为横坐标,绘制标准曲线。桔青霉素标准的色谱图参见图A.1和图A.2。5.4.3试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪,测定相应的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中桔青霉素的浓度。6分析结果的表述试样中桔青霉素含量按式(1)计算:X=ρ×V×fm……………………………(1)式中:X———试样中桔青霉素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);ρ———样液中桔青霉素的浓度,单位为微克每升(μg/L);V———定容体积,单位为毫升(mL);f———样液稀释倍数;m———样液所代表的试样量,单位为克(g)。计算结果需扣除空白值。计算结果保留两位有效数字。7精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。GB5009.222—201658其他本方法中大米、玉米、辣椒粉样品的检出限和定量限分别为8μg/kg和25μg/kg;红曲及其制品的检出限和定量限分别为25μg/kg和80μg/kg。第二法C18固相萃取小柱净化-高效液相色谱法9原理用乙腈-异丙醇-水的混合溶液提取试样中桔青霉素,C18固相萃取小柱净化,用配荧光检测器的液相色谱仪测定,外标法定量。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB6682规定的二级水。10.1试剂10.1.1异丙醇(C3H8O):色谱纯。10.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。10.1.3磷酸(H3PO4):优级纯。10.1.4甲醇(CH3OH)。10.2试剂配制10.2.1提取溶剂:乙腈-异丙醇-水(35+10+55),用磷酸调pH为1.5。10.2.2磷酸溶液(0.08mol/L):取5.6mL磷酸,以水定容至1L。10.2.3流动相:乙腈-异丙醇-磷酸溶液(35+10+55)。10.3标准品桔青霉素(C13H14O5,CAS号:518-75-2),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。10.4标准溶液配制10.4.1桔青霉素标准储备液:称取适量桔青霉素标准物质,用乙腈溶解并定容至1.0mg/mL,0℃~4℃保存。10.4.2桔青霉素标准工作液:根据需要用流动相将标准储备液稀释成25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的标准工作溶液。10.5材料10.5.1C18固相萃取柱:填料500mg,柱体积3mL,或等效柱。10.5.2玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm。GB5009.222—2016611仪器和设备11.1高效液相色谱仪:配有荧光检测器。11.2振荡器。11.3离心机:≥6500r/min。11.4真空固相萃取装置。11.5氮吹仪。11.6分析天平:感量0.0001g和0.01g。12分析步骤12.1提取取样品500g,用粉碎机粉碎并通过830μm圆孔筛,混匀,分成2份,装入洁净容器内,密封保存。称取试样约5g(精确至0.01g)于50mL离心管中,加10mL提取溶剂(10.2.1),在振荡器上振荡提取30min。以3500r/min离心4min,上清液转入另一离心管中。在残渣中再加入5mL提取溶剂(10.2.1),重复上述操作,合并上清液。在提取液中加水至40mL,并用磷酸调pH为1.5,过玻璃纤维滤纸,待净化。12.2净化将上述溶液过预淋洗好的C18固相萃取柱,用5mL水淋洗柱子。待淋洗液全部流出柱子后,减压抽干3min。用10mL甲醇以1.0mL/min的速度洗脱,收集全部洗脱液,在40℃下,N2吹干,再以1.0mL流动相溶解,过0.22μm的有机相微孔滤膜,供液相色谱测定。12.3空白试验除不加试样外,均按上述操作步骤进行。12.4测定12.4.1液相色谱参考条件a)色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效者;b)流动相:乙腈-异丙醇-磷酸溶液(35+10+55);c)流速:1.0mL/min;d)进样量:50μL;e)柱温:28℃;f)检测波长:激发波长331nm,发射波长500nm。12.4.2色谱测定根据样液中被测桔青霉素含量情况,选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作液和样液中桔青霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下,桔青霉素保留时间约为9.1min,标准物质色谱图见图A.3。13分析结果的表述试样中桔青霉素含量按式(2)计算:GB5009.222—20167X=A×ρ×VAs×m……………………………(2)式中:X———试样中桔青霉素含量,单位为微克每千克(μg/kg);A———样液中桔青霉素的峰面积;ρ———标准工作液中桔青霉素的浓度,单位为微克每升(μg/L);V———样液最终定容体积,单位为毫升(mL);As———标准工作液中桔青霉素的峰面积;m———最终样液