环境样品前处理

1硅胶的活化：DCM（CH2CL2清洗硅胶）(进口的不需要清洗，国产的要清洗)：将硅胶装于玻璃柱中3倍于硅胶体积的甲醇清洗（大约800－1000mL的甲醇）同体积的DCM清洗（大约500ML的DCM）将硅胶置于铝箔纸上，通风厨过夜让溶剂挥发干净（或者N2吹干）马福炉中550℃烘烤至少12hrs,然后降温到180℃停留至少1hr取出在干燥器中降温后，转制烧瓶中加塞密闭，于干燥器中备用。Note:在玻璃柱中清洗时防止硅胶有断层出现酸性硅胶的配制30％酸性硅胶的配制于烧瓶中称取100g活化硅胶于硅胶上逐滴滴入浓H2SO4共40g(硫酸密度为1.84g/mL)计算公式为x/(x+100)=30％，x=42.86g,42.86/1.84=23.3mLNote边加边摇，以防结块，或置于摇床上至硅胶为均匀流动状态置于干燥器中保存若配制时用50g硅胶，那么H2SO4取11.65mL(大约为21.4g)22%酸性硅胶：8mL浓H2SO4加50g活化硅胶44%酸性硅胶：43mL浓H2SO4加100g活化硅胶44%酸性硅胶：21.5mL浓H2SO4加50g活化硅胶43×1.84/(100+43×1.84)=44%2Note:楼上的方法不能用于楼下，因为所用的硅胶不同，色谱行为就不同，即使柱形一样。因为楼上用的硅胶与楼下的不同，所以不能方法混用。楼上硅胶是国产，楼下的是进口的。碱性硅胶的配制（1.2%）100g活化硅胶滴入30g1N的NaOH(1NNaOH:1.2gNaOH溶于30mL水)注意：不要使硅胶沾到烧瓶的内磨口上，否则盖子关上后容易粘住打不开楼上用的是33%的碱性硅胶（水＋NaOH）/(水＋NaOH+硅胶)＝33%1gNaOH加到25mL水里，即配制成了1mol/L的溶液，然后加入到50g活化硅胶中。氧化铝：酸性氧化铝的活化酸性氧化铝装于烧瓶中（体积不超过一半）用铝箔纸疏松的盖住瓶口在干燥烘箱中130℃过夜（至少12hrs）干燥器中加塞密闭干燥器中备用3碱性氧化铝：（最好在两周内使用，后者最好在5天内用完，否则易失活，可能需要重新活化）碱性氧化铝盛于蒸发皿中马福炉中600℃烘至少24hrs降温到130℃停留至少3hrs干燥器中降温后转至烧瓶中，于干燥器中备用弗罗里土：Florisil(硅酸镁)150mm×5mmID小柱底部用玻璃棉轻轻塞住取1g弗罗里土装于柱子中，并且轻轻拍动柱子让填料均匀沉降上层再装约1cm的无水Na2SO450mLDCM清洗小柱卸去四氟阀，放于通风橱中过夜，让溶剂挥发干整个柱子置于干燥烘箱中，140℃至少24hrs如不使用则在140℃下存放Note：使用时将柱取出降至室温，90分钟内使用，否则重新活化。4AgNO3硅胶（10%）的配制5.6gAgNO3溶于21mL超纯水中逐滴加入到50g活化硅胶中（或者11.2gAgNO3+35mL水+100g硅胶）用铝箔纸将装AgNO3硅胶的烧瓶全部包裹住，烧瓶口用铝箔纸疏松地盖住，置于干燥烘箱中烘箱中30℃烘5hrs(至少5hrs)升温到60℃停留3hrs中间慢点升温升温到180℃至少12hrs干燥器中降温后加塞密闭（保存在棕色干燥器中备用）Note:如果在制作过程中发现AgNO3硅胶颜色加深或者局部变为灰黑色，应该弃去此次配制。变色原因：升温过快。Note:装AgNO3的小烧杯要尽快用超纯水洗净，否则AgNO3会粘到烧杯上，不容易洗干净。Na2SO4：660℃下马福炉中烘至少6hrs（优级纯）注意：提取筒洗过后要在马福炉里420℃烘一段时间纯化注意事项：1所有纯化柱均采用干法装制；2装好填料后轻拍柱子至填料表层平整；3一旦加上洗脱液后，则不要再拍动柱子；4一定量的hexane预淋洗进行稳定，并且除去部分污染杂质；5预淋洗时流速控制在2滴/S;6填料若出现断层则不能再使用；7上柱样品后，用1mL正己烷清洗烧瓶；8要等上一组分液面约1mm时再上样；59若是做流出曲线，对体积要求就会严格一些，接流出物的量筒用铝箔包上，防止溶剂挥发。酸洗or酸性硅胶柱：1.5cm内径（15mmID）结构式－Si－O－玻璃毛填充5g44%酸性硅胶5g22%酸性硅胶（这个是为了防止44%硅胶发生炭化）2g活化硅胶2cm无水Na2SO450mL---70mL的Hexane淋洗样品上样70mL---100mLHexane洗脱旋转蒸发至2---3mL2cm无水Na2SO42g活化硅胶5g22%酸性硅胶5g44%酸性硅胶6淋洗用的Hexane量由所加的硅胶量决定，若酸性硅胶（22%+44%）一共才10克，就不用100mLHexane洗脱，70mL足够，太多反而将杂质洗脱下来了。预淋洗用溶剂量也不一定要50mL—70mL,由硅胶量决定。酸洗前一定要记住：一定要将溶剂置换为Hexane再酸洗。硫酸硅胶柱净化容量不足，杂质易与dioxin及PCBs竞争氧化铝及florisil的活性基位（Activesites），使dioxin及PCBs在流洗过程中损失，降低了回收率。故acidsilica要不能被穿透为止（由管柱的颜色外观可以判定是否被穿透）Note：酸洗前，若样品溶剂为DCM，要将DCM置换成Hexane，CH2CL2不能与H2SO4混合，过酸性柱前将甲苯溶剂也要置换为Hexane,甲苯剩下的越少越好。酸洗：（注意酸洗最多次数不要超过3次，否则影响回收率）在溶液中加入15g酸性硅胶和搅拌磁子，在磁力搅拌器上搅拌30mins取上清液过无水Na2SO4小柱剩下的硫酸硅胶用10－20ML的Hexane清洗两次（于磁力搅拌器上搅拌各10分钟）每次清洗后过无水Na2SO4小柱，一并收集合并后收集浓缩酸性硅胶柱可以吸附许多离子或者非离子性官能基化合物，包括生物碱，糖脂，配糖物（醣），染料，碱金属离子，脂质，甘油，类固醇，可塑剂，多环芳香族化合物及酚类衍生物等。7酸碱硅胶柱纯化（复合硅胶柱）30cm×15mmID底部有200目玻璃砂芯和四氟磨口阀1g活化硅胶1g活化硅胶4g碱性硅胶4g碱性硅胶1g活化硅胶1g活化硅胶8g酸性硅胶8g酸性硅胶2g活化硅胶1g活化硅胶1cm无水Na2SO42gAgNO3硅胶100mLHexane预淋洗2cm无水Na2SO475mLHexane洗脱100mLHexane预淋洗上样后用150mL(DCM/Hexane=5/95)洗脱82cm无水Na2SO42cm无水Na2SO41g活化硅胶2gAgNO3硅胶8g44%酸性硅胶1g活化硅胶8g酸性硅胶1g活化硅胶3g碱性硅胶1g活化硅胶1g活化硅胶4g碱性硅胶1.5g－2gAgNO3硅胶1g活化硅胶1g活化硅胶楼下的方法：先用100mLHexane预淋洗，上样后用150mL洗脱。DCM/Hexane＝5/95楼上的方法：先用70mL---90mLHexane预淋洗，上样后，用100mLHexane洗脱。注意：AgNO3硅胶不要加得太多，它对PCBs有吸附作用，AgNO3硅胶尽量称得准确些，它对流出曲线影响较大些（AgNO3有一定的极性）分析PBDE时，要用铝箔纸将层析柱包上，防光（PBDE与AgNO3都要防光）分析PBDE时是一样的柱子，一样的填料，洗脱是先100mLHexane预淋洗，上样后先用70mLHexane洗，弃去，再用70mL1：1（DCM/Hexane）洗，这时洗下的就是含有PBDE的成分。1cm无水Na2SO46g酸性or碱性氧化铝9氧化铝纯化柱：30cm×15mmID玻璃柱6g酸性or碱性氧化铝1cm无水Na2SO4100mLHexane预淋洗酸性氧化铝碱性氧化铝DCM:Hexane(1:1,V:V)DCM:Hexane(1:1,V:V)40mL洗脱30mL－40mL洗脱旋蒸时留1mL左右，因为弗罗里土纯化柱太细，要减小上样的高度，洗脱时注意控制流速，不能太快，塞子不要垂直，倾斜既可弗罗里土纯化柱：柱型150mm×5mmID玻璃棉1g弗罗里土1cm无水Na2SO450mLDCM清洗溶剂挥发（要卸下塞子）140℃下至少烘24hrs冷却后90min内使用（装上塞子）50mLHexane预淋洗35mL收集PCBs（30mL-35mL洗脱）DCM:Hexane(5:95,V:V)DCM（二氯甲烷）40mL-45mL收集dioxins10生物组织脂肪含量测定和去除：提取脂肪前烧瓶称重提取液转移至此烧瓶旋转浓缩近干后移至N2流下将多余溶剂吹走，直至天平称重无变化（百分位天平）称量提取后烧瓶重两次重量差即为脂肪含量脂肪含量＝【（提取后烧瓶重－提取前烧瓶重）/提取样】×（1－组织水分百分含量）称脂后加50mLHexane溶解提取物15g酸性硅胶，搅拌磁子搅拌30mins过无水Na2SO4小柱5mLHexane清洗两次合并收集后浓缩楼上氧化铝0.8cmID,细柱，半湿法装柱若是1.0cmID,则Al2O3用10g柱中加30mLHexane8gAl2O31cmNa2SO4预淋洗（30mL-40mLHexane洗脱）上样DCM/Hexane＝5：95100mL洗脱PCBsDCM/Hexane＝1:150mL洗脱dioxins11凝胶渗透色谱GPC填料：Bio-BeadsSX3GPC柱型30cm×25mmID(柱子下面有砂芯)填料30g于烧杯中加入DCM:Hexane（1：1，V：V）全部盖住铝箔纸盖住烧杯置于通风橱过夜，至少12hrs,填料充分溶胀搅动填料，并用吸管逐步将填料转移到柱中，中间打开四氟阀放去多余的溶剂全部转移后，上部留有10cm溶剂上端加塞，底部关阀整个柱子倒置后打开阀门振荡柱体，使填料逐渐整体均匀倒置关闭阀门，将柱子缓慢扶正，并且打开上面的磨口塞，可以看到填料均匀沉降直至完全应该无断层，无气泡，无沉降分界层500mLDCM：Hexane（1:1,V:V）淋洗，（注意要将溶剂混合均匀）滴速2－3滴/S不用时关阀加塞密闭，上层留有5CM以上的溶剂，GPC使用溶剂均为DCM：Hexane（1：1，V:V）若长时间没用，纯化前用100mL溶剂预淋洗GPC洗脱DCM：Hexane(1:1,V:V)100mL预淋洗（量筒接）量筒1上样后，先用50mLDCM：Hexane(1:1,V:V)去掉大分子（量筒接）量筒2另外量筒接70mL(DCM/Hexane=1/1)为PCB量筒3另外量筒接50mL,量筒4量筒4与量筒250mL合并保存，以防重复实验时回收再分析12注意：1若GPC柱中物料层有气泡，则上面用塞子堵上，稍微晃一下柱子可以去除。若溶剂干了会造成断层。2GPC柱用前由于重心作用，上层发胀，所以需要释放一段洗脱溶剂，将发胀部分压下去，再上样。N2吹纯化后样品旋转蒸发转移入KD管后N2吹剩下0.2-0.3mL左右进样小瓶瓶芯中加15uL的壬烷Kd管中样品转移至瓶芯N2吹（温度不要太高30℃－60℃，太高有损失）洗KD管用DCMorHexane至少洗2次，合并到进样小瓶瓶芯中N2吹至瓶芯拐弯处上1mm－2mm处加入回收标保证进样小瓶中最后溶液约为20µL左右涡轮注意进样小瓶与瓶芯大小要搭配加标前标准溶液需要提前从冰箱中拿出来平衡大约10几分钟13配制标准溶液：举例PBB标样转移到棕色小瓶A小瓶A用DCM清洗3次（涡轮）贴标签纸（标签纸不要贴太大，用透明胶贴一下）称空瓶重量W0将装标样的安培小瓶B按划线掰开DCM清洗一下滴管，晾干，用滴管将标样安培瓶里的标准溶液吸出转移入小瓶A称量装标后的小瓶与标的重量W1那么W1-W0即为取的标的重量C18柱结构式：－Si－C18H37目的：清除极性物质，ex:蛋白，脂质铜粉去S前铜粉的准备铜粉置于烧瓶中6MHCL倒入清洗，不锈钢药勺搅拌倒掉HCL，超纯水清洗数次，洗净HCL为止倒入丙酮清洗数次，将水洗净将铜粉晾干备用（晾干的方法可以用N2吹干）14分析PBDE时所用的方法1.5gAgNO3装到柱子里（30cm×15mmID玻璃柱）50mLor30mLHexane预淋洗100mLHex洗PCB+dioxin50mL10%DCM+90%Hexane洗PBDE