GB 1903.44-2020 食品安全国家标准 食品营养强化剂 羟钴胺

书书书中华人民共和国国家标准犌犅１９０３．４４—２０２０食品安全国家标准食品营养强化剂　羟钴胺２０２００９１１发布２０２１０３１１实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布书书书犌犅１９０３．４４—２０２０１　　　　食品安全国家标准食品营养强化剂　羟钴胺１　范围本标准适用于以粘着剑菌（犈狀狊犻犳犲狉犪犱犺犪犲狉犲狀狊）发酵法生产，经提纯、干燥制得的食品营养强化剂羟钴胺。２　分子式、结构式和相对分子质量２．１　分子式Ｃ６２Ｈ８９ＣｏＮ１３Ｏ１５Ｐ２．２　结构式２．３　相对分子质量１３４６．３８（按２０１８年国际相对原子质量）３　技术要求３．１　感官要求感官要求应符合表１的规定。表１　感官要求项目要求检验方法色泽深红色状态晶体或结晶性粉末取适量试样置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下，观察其色泽和状态犌犅１９０３．４４—２０２０２　　　　３．２　理化指标理化指标应符合表２的规定。表２　理化指标项目指标检验方法羟钴胺含量（以无水和无溶剂计），狑／％９５．０～１０２．０附录Ａ．３水分，狑／％１４．０～１８．０ＧＢ５００９．３卡尔·费休法有关物质（以无水和无溶剂计），狑／％≤４．０附录Ａ．４丙酮，狑／％≤０．５附录Ａ．５ｐＨ（２０ｇ／Ｌ）８．０～１０．０附录Ａ．６铅（Ｐｂ）／（ｍｇ／ｋｇ）≤２．０ＧＢ５００９．７５或ＧＢ５００９．１２总砷（以Ａｓ计）／（ｍｇ／ｋｇ）≤２．０ＧＢ５００９．７６或ＧＢ５００９．１１犌犅１９０３．４４—２０２０３　　　　附　录　犃检验方法犃．１　一般规定除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和ＧＢ／Ｔ６６８２中规定的一级水。试验方法中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按ＧＢ／Ｔ６０１、ＧＢ／Ｔ６０２的规定制备。所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。犃．２　鉴别试验犃．２．１　试剂和溶液犃．２．１．１　溴化钾。犃．２．１．２　焦硫酸钾。犃．２．１．３　盐酸。犃．２．１．４　冰醋酸。犃．２．１．５　乙酸钠。犃．２．１．６　酚酞指示液：０．１ｇ酚酞用９５％的乙醇溶解并定容到１００ｍＬ。犃．２．１．７　氢氧化钠溶液：２ｍｏｌ／Ｌ。称取４０ｇ氢氧化钠，用水溶解并定容至５００ｍＬ。犃．２．１．８　醋酸溶液：１ｍｏｌ／Ｌ。移取５８．８ｍＬ冰醋酸于１Ｌ的容量瓶中并用水定容。犃．２．１．９　１亚硝基２萘酚３，６二磺酸钠溶液：将１ｇ１亚硝基２萘酚３，６二磺酸钠溶于适量水中，转至１００ｍＬ容量瓶中并用水定容。犃．２．２　红外光谱分析红外光谱分析按ＧＢ／Ｔ６０４０—２００２中５．２．２执行，试样的红外吸收光谱图应与盐酸羟钴胺的标准谱图一致，盐酸羟钴胺的标准红外光谱图如附录Ｂ的Ｂ．１所示。犃．２．３　钴离子鉴别将１ｍｇ羟钴胺和约５０ｍｇ焦硫酸钾放置于坩埚中，在电热板上逐渐加热，直至固体熔融，冷却，用玻璃棒捣碎，加入３ｍＬ水，煮沸直至溶解，加１滴酚酞指示液，逐滴滴加氢氧化钠溶液（Ａ．２．１．７）直到粉红色出现，加入０．５ｇ乙酸钠、０．５ｍＬ醋酸溶液（Ａ．２．１．８）和０．５ｍＬ１亚硝基２萘酚３，６二磺酸钠溶液（Ａ．２．１．９），立即呈现红色或橘红色。加入０．５ｍＬ盐酸，煮沸１ｍｉｎ，红色或橘红色保持不变。犃．２．４　试样与标准溶液主峰保留时间的比较在羟钴胺含量项下试验中，试样溶液（Ａ．３．２．９）与标准溶液（Ａ．３．２．８）的主峰保留时间应一致。犃．３　羟钴胺含量（以无水和无溶剂计）测定犃．３．１　方法提要用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过色谱柱使样品分离，用紫外吸收检测器或二极管阵犌犅１９０３．４４—２０２０４　　　　列检测器检测，用外标法定量，计算样品中羟钴胺的含量。犃．３．２　试剂和溶液犃．３．２．１　甲醇：色谱纯。犃．３．２．２　磷酸。犃．３．２．３　磷酸二氢钠。犃．３．２．４　盐酸羟钴胺标准品：ＣＡＳ号为５９４６１３０２，质量分数大于９５％。犃．３．２．５　磷酸溶液：取１ｍＬ磷酸于１００ｍＬ容量瓶中，加水定容至刻度。犃．３．２．６　缓冲液：称取１５．６ｇ磷酸二氢钠，溶于水，并定容至１０００ｍＬ，用磷酸溶液（Ａ．３．２．５）调ｐＨ至３．０。犃．３．２．７　稀释液：将甲醇、缓冲液（Ａ．３．２．６）和水按８∶１０∶８２（体积比）混合均匀。犃．３．２．８　标准溶液：按纯度折算，精密称取适量盐酸羟钴胺标准品，使之含盐酸羟钴胺０．０２ｇ，精确至０．０００１ｇ，用稀释液（Ａ．３．２．７）稀释至２００ｍＬ容量瓶中，定容作为标准溶液，使用前用０．４５μｍ微孔滤膜过滤，需做平行试样。犃．３．２．９　试样溶液：精密称取试样０．０２ｇ（按水分和溶剂残留之和折算后），精确至０．０００１ｇ，用稀释液（Ａ．３．２．７）溶解并定容至２００ｍＬ，作为试样溶液，使用前用０．４５μｍ微孔滤膜过滤，需做平行试样。犃．３．３　仪器和设备犃．３．３．１　电子天平，感量为０．１ｍｇ。犃．３．３．２　高效液相色谱仪。犃．３．４　参考色谱条件犃．３．４．１　检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。犃．３．４．２　检测波长：３５１ｎｍ。犃．３．４．３　色谱柱：两根极高纯度烷氧基硅胶为填料的整体柱（柱长１０ｃｍ，内径４．６ｍｍ，大孔２μｍ，中孔１３ｎｍ）串联或等效柱。犃．３．４．４　柱温：３０℃。犃．３．４．５　进样量：２０μＬ。犃．３．４．６　流动相：Ａ为甲醇，Ｂ为缓冲液（Ａ．３．２．６），Ｃ为水。梯度洗脱条件见表Ａ．１。表犃．１　流动相梯度洗脱条件时间／ｍｉｎ流动相ＡＢＣ０８％１０％８２％２０８％１０％８２％４０４０％１０％５０％４５８％１０％８２％５０８％１０％８２％犃．３．４．７　流速：２．０ｍＬ／ｍｉｎ。犃．３．５　系统适用性盐酸羟钴胺的保留时间大约为１６ｍｉｎ。犌犅１９０３．４４—２０２０５　　　　标准溶液（Ａ．３．２．８）色谱峰的拖尾因子应不大于２．５。标准溶液（Ａ．３．２．８）连续进样６次，主峰面积相对标准偏差（ＲＳＤ）应不大于１．０％。犃．３．６　分析步骤按照液相色谱仪操作规程依法操作，取标准溶液（Ａ．３．２．８）、试样溶液（Ａ．３．２．９）各２０μＬ注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法进行计算。犃．３．７　结果计算羟钴胺的质量分数狑１，数值以％表示，按式（Ａ．１）计算。狑１＝狉Ｕ×犆ｓ１×犕ｒ１狉ｓ１×犆Ｕ×犕ｒ２×１００…………………………（Ａ．１）　　式中：狉Ｕ　———试样溶液峰面积；犆ｓ１———盐酸羟钴胺标准溶液浓度，单位为毫克每毫升（ｍｇ／ｍＬ）；犕ｒ１———羟钴胺的摩尔质量，１３４６．４，单位为克每摩尔（ｇ／ｍｏｌ）；狉ｓ１———标准溶液峰面积；犆Ｕ———试样溶液中羟钴胺浓度，单位为毫克每毫升（ｍｇ／ｍＬ）；犕ｒ２———盐酸羟钴胺的摩尔质量，１３８２．８，单位为克每摩尔（ｇ／ｍｏｌ）。犃．３．８　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的２％。犃．４　有关物质（以无水和无溶剂计）的测定犃．４．１　试剂和溶液犃．４．１．１　甲醇：色谱纯。犃．４．１．２　磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。犃．４．１．３　磷酸。犃．４．１．４　缓冲液：称取磷酸二氢钠１５．６ｇ，经漏斗倒入１０００ｍＬ容量瓶中，加少量水溶解，加水至刻度。摇匀，经０．４５μｍ微孔滤膜过滤，用１∶１００磷酸溶液调ｐＨ至３．０，放入超声波水浴中脱气１０ｍｉｎ。犃．４．１．５　试样溶解液：精密量取经０．４５μｍ微孔滤膜过滤的水８２０ｍＬ，取１００ｍＬ缓冲液（Ａ．４．１．４）及８０ｍＬ甲醇进行混合，摇匀，放入超声波水浴中脱气１０ｍｉｎ。犃．４．１．６　系统适用性溶液：０．７５ｍｇ／ｍＬ。按纯度折算后，精密称取适量盐酸羟钴胺标准品（Ａ．３．２．４），用试样溶解液（Ａ．４．１．５）溶解定容至５０ｍＬ容量瓶中，使之浓度为０．７５ｍｇ／ｍＬ，作为系统适用性溶液。犃．４．１．７　定量溶液：７．５μｇ／ｍＬ。分别精密量取系统适用性溶液（Ａ．４．１．６）０．５ｍＬ，用试样溶解液（Ａ．４．１．５）溶解定容至５０ｍＬ容量瓶中。犃．４．１．８　限度溶液：０．７５μｇ／ｍＬ。精密量取定量溶液（Ａ．４．１．７）５ｍＬ，用试样溶解液（Ａ．４．１．５）溶解定容至５０ｍＬ容量瓶中，作为限度溶液。犃．４．１．９　试样溶液：０．７５ｍｇ／ｍＬ。精密称取试样０．０３７５ｇ（按水分和溶剂残留之和折算后），用试样溶解液（Ａ．４．１．５）溶解定容至５０ｍＬ容量瓶中，作为试样溶液。犃．４．２　仪器犃．４．２．１　电子天平，感量为０．０１ｍｇ。犌犅１９０３．４４—２０２０６　　　　犃．４．２．２　高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器或紫外检测器。犃．４．３　参考色谱条件同Ａ．３．４。犃．４．４　系统适用性按照液相色谱仪操作规程依法操作，取系统适用性溶液（Ａ．４．１．６）２０μＬ注入液相色谱仪中，记录色谱图，羟钴胺与其最近的杂质之间的峰谷比（与羟钴胺相邻的杂质小峰的峰高／羟钴胺主峰最低点的高度）必须不小于２．０。犃．４．５　分析步骤按照液相色谱仪操作规程依法操作，取限度溶液（Ａ．４．１．８）、试样溶液（Ａ．４．１．９）和定量溶液（Ａ．４．１．７）各２０μＬ注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法进行计算。获得试样溶液（Ａ．４．１．９）的色谱图，忽略面积小于限度溶液（Ａ．４．１．８）主峰的０．７倍的所有峰，将羟钴胺主峰保留时间设定为１．０，根据杂质峰与羟钴胺主峰相对保留时间记录杂质峰面积并计算其含量。杂质相对保留时间见表Ａ．２。表犃．２　有关物质杂质峰相对保留时间名　　称相对保留时间Ｂ６羟甲基衍生物０．４５Ｂ５羟甲基衍生物０．５３杂质１０．７０杂质２０．７５杂质３０．８２杂质４０．９３Ｃ８异构体１．２５杂质５１．３７～１．５１氰钴胺１．９０任一其他杂质—犃．４．６　结果计算羟钴胺有关物质的质量分数狑２，数值以％表示，按式（Ａ．２）计算。狑２＝∑犢犻…………………………（Ａ．２）　　某种杂质犢犻的质量分数按式（Ａ．３）计算。犢犻＝狉犻×犆ｓ２×犕ｒ１狉ｓ２×犆犻×犉×犕ｒ２×１００…………………………（Ａ．３）　　式中：犢犻　———某种杂质犻的质量分数，％；狉犻———试样溶液某个杂质峰面积；犆ｓ２———定量溶液中盐酸羟钴胺的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犌犅１９０３．４４—２０２０７　　　　犕ｒ１———羟钴胺的摩尔质量，１３４６．４，单位为克每摩尔（ｇ／ｍｏｌ）；狉ｓ２　———定量溶液（Ａ．４．１．７）盐酸羟钴胺峰面积；犆犻———试样溶液（Ａ．４．１．９）中羟钴胺的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犉———试样溶液响应因子，氰钴胺为０．８，其他杂质为１．０；犕ｒ２———盐酸羟钴胺的摩尔质量，１３８２．８，单位为克每摩尔（ｇ／ｍｏｌ）。犃．４．７　精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的１０％。犃．５　丙酮含量的测定犃．５．１　方法提要试样中存在的丙酮在密闭容器中会扩散到气相中，经过一定的时间后可达到气相／液相间浓度的动态平衡，用顶空气相色谱法检测上层气相中丙酮的含量，即可计算出待测试样中丙酮的实际含量。犃．５．２　试剂和溶液犃．５．２．１　丙酮贮备液（１０００μｇ／ｍＬ）：用２５０μＬ微量进样器量取０．１２７５ｍＬ丙酮标准（２０℃下丙酮的密度为０．７９０ｇ／ｃｍ３），直接注入已预加水约８０ｍＬ的１００ｍＬ容量瓶中（针头必须没入液面以下），再加水至刻度，摇匀，即得。犃．５．２．２　丙酮标准使用液（５０μｇ／ｍＬ）：量取丙酮贮备液（Ａ．５．２．１）５．００ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。犃．５．２．３　试样溶液：取试样约（５０±０．０５）ｍｇ，置于２０ｍＬ顶空瓶中，精密加入水５．０ｍＬ，封瓶，超声使溶解，即得。犃．５．２．４　参比溶液：取试样约（５０±０．０５）ｍｇ，置于２０ｍＬ顶空瓶中，加入５．００ｍＬ丙酮标准使用液（Ａ．５．２．２），封瓶，超声使溶解，即得。犃．５．３　仪器和设备犃．５．３．１　仪器：气相色谱仪