苗药红花龙胆化学成分及抗肿瘤活性研究结题汇报

苗药红花龙胆化学成分及抗肿瘤活性研究起止年限：2015年12月至2018年6月目录项目研究背景与意义123经费使用情况4项目考核指标及完成情况存在问题与今后工作5项目研究内容及完成情况1项目研究背景与意义红花龙胆为龙胆科植物红花龙胆GentianarhodanthaFranch.全草。具有清热燥湿，解毒泻火，止咳的功效。为贵州苗族习用药材。目前对其化学物质基础、生物活性等研究均不够深入。基于此，分离红花龙胆不同极性部位，并对其化合物进行结构鉴定。对萃取部位和单体化合物活性进行筛选，以期为寻找新型抗肿瘤先导化合物提供依据。一、项目研究背景与意义2项目研究内容及完成情况二、项目研究内容及完成情况序号合同规定实际完成内容完成评价1对苗药红花龙胆进行提取；选用不同的分离技术对粗提物进行化合物的分离纯化；根据光谱数据和化学性质，对分离到的化合物进行结构鉴定。采用超高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）对苗药红花龙胆95%乙醇提取物正丁醇部位的化学成分进行分析鉴定。从红花龙胆中共鉴定出化合物33个，包括环烯醚萜类10个，酚酸类6个，黄酮类5个，三萜类6个，苯甲酸碳苷类1个，吡喃酮类1个，其他类4个。其中24个化合物是首次报道。完成2对分离到的化合物选择性地进行抗肿瘤生物活性筛选。采用MTT法对红花龙胆有效部位及主要有效成分药物对K562、PC3和WM9肿瘤细胞的抑制作用进行了研究。完成（1）苗药红花龙胆血清药物化学初步研究建立了红花龙胆药材及其提取液灌胃后大鼠血清HPLC指纹图谱，通过色谱峰的相关性研究，确定了其入血移行成分，初步阐明了红花龙胆提取液在大鼠体内的主要药效物质基础。（2）苗族药红花龙胆有效成分芒果苷在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性研究半衰期和体外固有清除率均表明芒果苷代谢稳定性良好，且在不同种属之间无显著性差异。3.超额完成部分二、项目研究内容及完成情况（3）UPLC-MS/MS-超滤法测定芒果苷与大鼠的蛋白结合率采用超滤法结合已建立的UPLC-MS/MS法分别测定低、中、高三种浓度的芒果苷在大鼠血浆中的蛋白结合率，为其后期药效学药理学和临床研究提供依据。（4）基于线粒体分裂融合研究芒果苷对NaF损伤SH-SY5Y细胞的保护作用半衰期和体外固有清除率均表明芒果苷代谢稳定性良好，且在不同种属之间无显著性差异。二、项目研究内容及完成情况3.超额完成部分（5）红花龙胆对肺炎链球菌肺炎的治疗作用探讨苗药红花龙胆对肺炎链球菌感染性肺炎小鼠是否具有治疗作用，为进一步扩大民族医药红花龙胆的临床应用范围，提供实验依据。二、项目研究内容及完成情况3.超额完成部分二、项目研究内容及完成情况（1）UPLC-Q-TOF-MS法分析苗药红花龙胆化学成分红花龙胆负模式总离子流图红花龙胆正模式总离子流图罗君,赵琳珺,包江平.UPLC-Q-TOF-MS分析苗族药红花龙胆化学成分[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(24):89-94.通过设定合适的阈值参数，对红花龙胆正负离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物的准离子分子峰（如[M+H]+，[M-H]-）信息，根据供试品的色谱保留时间、质谱准离子峰和碎片离子等信息。通过龙胆属相关文献以及对照品信息进行数据分析，得到红花龙胆33个化学成分，其中包括（裂）环烯醚萜类10个，酚酸类6个，黄酮类5个，三萜6个，苯甲酸碳苷类1个，吡喃酮类1个，其他类4个。芒果苷裂解图（负）芒果苷裂解图（正）•芒果苷对照品正模式（C）和芒果苷对照品负模式（D）总离子流图二、项目研究内容及完成情况（2）红花龙胆有效部位及主要有效成分药物对K562、PC3和WM9肿瘤细胞的抑制作用药物不同提取部位名称抑制率石油醚部位-10%芒果苷-24%正丁醇部位53%乙酸乙酯部位38%马钱苷酸-15%•药物不同提取部位对K-562细胞的抑制率药物名称抑制率石油醚部位42%芒果苷15%正丁醇部位18%乙酸乙酯部位40%马钱苷酸5%•药物不同提取部位对PC-3细胞的抑制率•药物不同提取部位对WM9细胞的抑制率药物名称抑制率石油醚部位-16%芒果苷-6%正丁醇部位-22%乙酸乙酯部位11%马钱苷酸43%獐牙菜苷40%结果表明，当药物浓度均为100μg/ml时，正丁醇部位对K-562细胞的抑制作用最强，乙酸乙酯部位对K-562细胞的抑制作用次之，另外三种（石油醚部位、芒果苷、马钱苷酸）对K-562细胞均无抑制作用；石油醚部位和乙酸乙酯部位对PC-3细胞的抑制作用相近，抑制率达40%，芒果苷和正丁醇部位对PC-3细胞的抑制作用较弱，马钱苷酸对PC-3细胞的抑制作用最低；马钱苷酸对WM9细胞的抑制作用最强，獐牙菜苷对WM9细胞的抑制作用次之，乙酸乙酯部位对WM9细胞的抑制作用最弱，其他三种（石油醚部位、芒果苷、正丁醇部位）对WM9细胞均无抑制作用。（3）苗药红花龙胆血清药物化学初步研究二、项目研究内容及完成情况建立了红花龙胆药材及其提取液灌胃后大鼠血清HPLC指纹图谱，通过色谱峰的相关性研究，确定了其入血移行成分，初步阐明了红花龙胆提取液在大鼠体内的主要药效物质基础。通过比较红花龙胆灌胃液、红花龙胆提取液含药血清、空白血清及芒果苷HPLC发现，除去血清中的固有成分（7号、14号），红花龙胆含药血清中出现20个移行成分，其中有3个成分为红花龙胆药材中的原型成分，即11，12，13号峰，通过对照品对照及特征峰的紫外光谱图，确认11号峰为芒果苷。其余各成分可能为大鼠口服红花龙胆后其在体内转化的代谢产物，各代谢物的鉴定和来源有待进一步研究。二、项目研究内容及完成情况（4）苗族药红花龙胆有效成分芒果苷在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性研究半衰期和体外固有清除率均表明芒果苷代谢稳定性良好，且在不同种属之间无显著性差异。RT:0.00-6.010.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance0.550.540.570.530.500.493.670.931.831.295.193.690.771.515.490.100.982.192.694.051.674.875.504.664.512.743.193.665.751.853.492.312.112.62NL:4.37E1TICMSKBJC空白孵育样品质谱色谱图芒果苷与内标对照样品质谱色谱图肝微粒体孵育样品质谱色谱图样品浓度(μg/L)准确度(%)日内精密度RSD(%)日间精密度RSD(%)稳定性(%)587.66±2.282.608.6285.68±5.1310096.28±5.796.017.2892.31±3.1960088.36±7.388.359.8998.55±6.08芒果苷的准确度、精密度以及稳定性测定结果(n=5)样品浓度(μg/L)提取回收率(%)提取回收率RSD(%)基质效应基质效应RSD(%)585.26±2.232.62%86.42±5.486.3410092.87±4.795.16%85.72±6.227.2660088.13±4.284.86%94.56±4.084.31内标87.08±7.198.26%95.81±5.065.28芒果苷提取回收率、基质效应及其相关RSD测定结果(n=5)芒果苷在3个不同种属肝微粒体孵育实验结果(n=3)芒果苷在不同种属肝微粒体孵育的剩余百分率组别孵育60min剩余率(%)半衰期T1/2（min）体外固有清除率CLint(μL/min/mg)芒果苷+SD鼠肝微粒体97.88±1.19866.251.60芒果苷+Beagle犬肝微粒体102.26±1.03845.121.64芒果苷+人肝微粒体97.88±5.70924.001.50在反应60min后，芒果苷的量几乎没有任何改变，可此可知，I相代谢途径对它的消除贡献都比较微弱。底物消除情况很难与系统误差区分，只粗略地对其消除结果进行线性回归，所得的T1/2和CLint均表明芒果苷代谢稳定性良好，且在不同种属之间无显著性差异。在后续的实验可以考虑用SD大鼠来研究药物的代谢二、项目研究内容及完成情况（5）UPLC-MS/MS-超滤法测定芒果苷与大鼠的蛋白结合率采用超滤法结合已建立的UPLC-MS/MS法分别测定低、中、高三种浓度的芒果苷在大鼠血浆中的蛋白结合率，为其后期药效学药理学和临床研究提供依据，为其后期药效学药理学和临床研究提供依据。A：空白血浆；B：芒果苷标准品；C：芒果苷孵育液血浆样品加入量/μg·L-1游离质量浓度/μg·L-1血浆蛋白结合率/%大鼠血浆10040080065.86±3.41268.92±9.28531.36±25.2165.86±3.4167.23±2.3266.42±3.15不同质量浓度芒果苷在大鼠血浆中的蛋白结合率（±s，n＝3）采用低、中、高3种质量浓度(100，400，800μg·L-1)，分别对芒果苷与大鼠血浆、家兔血浆及人血浆的蛋白结合率进行考察。将实验数据用SPSS20.0软件进行统计分析，分别对不同质量浓度之间的血浆蛋白结合率进行单因素方差分析，结果表明，不同浓度的芒果苷在血浆中的蛋白结合率无显著性差异（P＞0.05）。通过NaF刺激人神经母瘤细胞（SH-SY5Y），建立体外氟中毒细胞模型，观察芒果苷对细胞内线粒体分裂融合蛋白的表达水平的影响，探讨其对NaF诱导细胞损伤的保护作用及机制。二、项目研究内容及完成情况（6）基于线粒体分裂融合研究芒果苷对NaF损伤SH-SY5Y细胞的保护作用芒果苷浓度(μmol/L)细胞增值率（%）436.3±27.2*268.5±18.7*162.6±4.5*0.569.6±10.80.2577.5±4.50.12583.6±29.10.062598.6±24.00.0312584.7±6.10（溶媒）100.0±18.5与溶媒组相比，芒果苷浓度为0.03125～0.5μmol/L时对SH-SY5Y细胞的增殖无明显影响。而当芒果苷浓度达到1μmol/L及以上浓度时，芒果苷对SH-SY5Y细胞的增殖产生明显抑制作用（p0.05）。芒果苷对正常SH-SY5Y细胞的增殖的影响芒果苷对NaF损伤SH-SY5Y细胞增殖的影响二、项目研究内容及完成情况组别芒果苷浓度（μmol/L）细胞增殖率（%）溶媒组0100.0±4.5NaF组057.8±7.9*芒果苷高浓度组5094.8±14.0#芒果苷中浓度组2590.5±9.8#芒果苷低浓度组12.559.0±2.8**P0.05vs.溶媒；#P0.05vs.NaF与溶媒组相比，NaF组细胞增殖率明显降低（p0.05），提示NaF对SH-SY5Y细胞增殖产生明显抑制作用；与NaF组相比，芒果苷中、高浓度明显增加NaF损伤SH-SY5Y细胞增殖（p0.05），提示芒果苷对NaF损伤SH-SY5Y细胞具有明显保护作用。与溶媒相比，NaF明显降低线粒体分裂相关蛋白drp-1、fis-1的表达水平（p0.05），明显增高线粒体融合相关蛋白mfn-1的表达水平（p0.05），而对融合相关蛋白mfn-2、opa-1表达则无明显影响（p0.05）；与NaF相比，芒果苷低、中、高浓度均明显增加分裂相关蛋白drp-1、fis-1蛋白表达（p0.05），芒果苷高浓度明显降低融合相关蛋白mfn-1蛋白表达（p0.05），而芒果苷对融合相关蛋白mfn-2、opa-1无明显影响（p0.05）。芒果苷对NaF损伤的SH-SY5Y细胞具有明显保护作用，其作用可能与其促进NaF损伤SH-SY5Y细胞线粒体分裂，抑制细胞线粒体融合有关。探讨苗药红花龙胆对肺炎链球菌感染性肺炎小鼠是否具有治疗作用，为进一步扩大民族医药红花龙胆的临床应用范围，提供实验依据二、项目研究内容及完成情况（7）红花龙胆对肺炎链球菌肺炎的治疗作用红花龙胆水煎剂灌胃，可改善小鼠机体炎性因子水平，并减少肺炎链球菌对肺组织的浸润和损伤作用。3项目考核指标及完成情况三、项目考核指标及完成