第八章基因工程与体外表达doc-wwwxymunet

中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因工程与体外表达授课对象：医学七年制、八年制授课时数：6学时授课教师：曾海涛授课地点：授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材）胡维新主编，北京：科学出版社，2007，第一版第八章基因工程与体外表达一、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。二、讲授重点：基因克隆的基本过程。三、讲授难点：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：第一节基因工程中的工具酶一、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。1．限制性核酸内切酶的分类Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用。这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1000bp处切割DNA。Ⅱ型酶能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。2．限制性内切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株3．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端.PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端.有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如SmaⅠ.二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)有聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。2.DNA聚合酶Ⅰ大片段DNA聚合酶Ⅰ大片段(largefragmentofDNApolymeraseI)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。有5ˊ→3ˊ聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途有：(1)补齐双链DNA的3ˊ末端。(2)通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。(3)在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4)DNA序列分析。3.逆转录酶（reversetranscriptase）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3ˊ-OH引物，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。4.T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。5.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能去除DNA或RNA5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。6.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。第二节基因克隆的载体外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体(vector)来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。一、质粒（plasmid）质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。质粒含有复制起始点，此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子，能利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制及转录。作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。二、λ噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌的病毒，用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是λ噬菌体，另一种是M13噬菌体。野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。λgt11为表达型载体。三、粘性质粒（cosmid）粘性质粒是由λ噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50kb。四、M13噬菌体M13噬菌体（M13phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。当每个细菌体内的复制型M13拷贝数积累到100～200后，M13的合成就变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量的单链DNA，并被包装到成熟的噬菌体颗粒中，然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌体内释放出的颗粒中所含的单链DNA。五、病毒载体逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。第三节基因克隆的基本过程基因克隆主要分为以下几个步骤：①制备目的基因和相关载体；②将目的基因和有关载体进行连接；③将重组的DNA导入受体细胞；④DNA重组体的筛选和鉴定；⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究。一、目的基因的获得（一）从基因组文库中获得一个生物体的基因组ＤＮＡ用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段克隆在载体ＤＮＡ分子中,所有这些插入了基因组ＤＮＡ片段的载体分子的集合体,将包含了这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生物体的基因文库。（二）从cDNA文库（cDNAlibrary）中获得cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆.（三）PCR扩增特定基因（四）人工合成二.载体的选择与准备根据目的基因的大小和研究的目的选择合适的载体。三、DNA分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接四、外源基因导入宿主细胞将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化（transformation）感染（infection）和转染（transfection）.（一）转化（transformation）转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（0～5℃）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competentcell）。（二）感染（infection）λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。（三）转染（transfection）转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法（electroporation）、CaPO4沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。五、目的基因的筛选与鉴定将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。（一）遗传学方法1.抗生素筛选法(1)单抗生素筛选大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）、四环素(Tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。用该法可筛选出转化子，但不能区分含目的基因的转化子和不含目的基因的转化子。（2）双抗生素筛选含有两个或两个以上选择标志的载体,如pBR322带有Amp和Tet抗性基因，将外源基因插入Tet基因内，则Tet基因失活，所构建的重组质粒转化菌落能在含Amp的培养板中生长，而不能在含Tet的培养板中生长。2.蓝-白筛选（α互补）用图表示许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，α互补能正常进行，产生有活性的β-半乳糖苷酶。当在诱导剂IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和人工底物X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在时，产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无α互补能力的氨基端片段。在IPTG及X-gal存在时，带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。（二）免疫学方法如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。（三）核酸杂交法对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。进行原位杂交时，先将重组质粒或重组噬菌体的细菌生长在琼脂平板上，形成单个菌落或噬菌斑，再把圆型硝酸纤维膜或尼龙膜覆盖于长有菌落或噬菌斑的琼脂平板的表面，定好位，把膜轻轻揭起，这样就有部分细菌或噬菌体吸附于膜上，再用碱处理膜上的DNA，使之变性。烘干固定DNA，然后用32P标记的DNA或RNA探针杂交、洗膜、用X光片曝光。凡是含有与探针DNA互补序列的菌落或噬菌斑，在放射自显影后，会在X光片上产生阳性斑点。然后根据斑点在平板上的相应位置，找出阳性克隆。（四）PCR技术PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。(五)酶切鉴定用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。第四节真核细胞转染一.真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙共沉淀法（calciumphosphateco-precipitat