硕士论文-MHC肽四聚体技术在CTL表位鉴定中的应用

第三军医大学硕士学位论文MHC-肽四聚体技术在CTL表位鉴定中的应用姓名：熊锐华申请学位级别：硕士专业：中西医结合临床指导教师：张荣华20090501MHC-肽四聚体技术在CTL表位鉴定中的应用作者：熊锐华学位授予单位：第三军医大学相似文献(10条)1.期刊论文梁彬.黄河MHC-肽四聚体技术在造血干细胞移植中的应用-国外医学(输血及血液学分册)2002,25(5)MHC-肽四聚体技术是一种直接监测抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的新方法,具有较强的特异性和敏感性.本文就MHC-肽四聚体技术在造血干细胞移植后巨细胞病毒特异性CTL、次要组织相容性抗原(mHags)特异性CTL以及肿瘤抗原特异性CTL的检测及其意义进行综述.2.学位论文李绍飞MHC-肽四聚体的构建及其技术改造研究2007背景和目的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL或Tc）在T细胞免疫应答中发挥着重要的作用，它通过识别靶细胞表面的MHC—肽复合物而对靶细胞进行杀伤。检测和监测抗原特异性CTL，是了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一，也是评价特异性免疫疗法的基础。抗原特异性CTL的体外检测方法有多种，但MHC—肽四聚体技术是目前唯一能够直接对其定量检测的方法。然而，MHC—肽四聚体构建过程复杂，价格昂贵，这在一定程度上限制其大规模应用，这就要求我们一方面要构建针对不同抗原表位的MHC—肽四聚体，另一方面也要求我们开展MHC—肽四聚体技术改造研究，简化MHC—肽四聚体制备过程，提高其实用性和可操作性，开发具有自主知识产权的产品，以适合和满足我国医学飞速发展的需要。另外，慢性HBV感染是一个全球性的重大健康问题。HBV有多种抗原成分，而每种抗原成分包含有多个抗原表位，构建HBV不同抗原表位的MHC—肽四聚体很有必要。本文首先使用MHC—肽四聚体构建的基本方法构建HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体，一方面可以为检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107—115表位特异性CTL打下基础，另一方面摸索和掌握MHC—肽四聚体构建技术，可以为构建其它抗原表位的MHC—肽四聚体或为建立抗原特异性CTL检测的技术平台打下基础；其次将SCT改造为HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体，以期为MHC—肽四聚体技术改造提供新思路。试验方法（1）HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚体的构建分别将重组A2—BSP和β2m的载体用化学法转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，对转化菌落进行培养和用IPTG诱导，表达出包涵体蛋白；提取两种包涵体蛋白，经SDS—PAGE电泳分析表明两个蛋白均被表达，大小分别为33KD和12KD；将两种包涵体蛋白和HBcAg107—115抗原肽共同稀释复性，以组装成MHC—肽复合物单体；用超滤器浓缩复性产物；用凝胶过滤层析技术纯化MHC—肽复合物单体，经SDS—PAGE电泳分析表明获得了目的蛋白；MHC—肽复合物单体在BirA酶的作用下生物素化；用超滤管离心去除生物素化产物中游离的生物素；用直接ELISA法定性鉴定生物素化产物；用BCA法测定生物素化蛋白浓度，并将生物素化蛋白和PE标记的链亲和素以4：1的量混合作用，从而得到MHC—肽四聚体。（2）HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体活性的检测取免疫的转基因鼠两只，其中一只为对照;取出脾脏，分离出脾脏细胞并调节浓度;先后用制备的MHC-肽四聚体、FICT标记的anti-CD8+抗体和PE-Cy5标记的anti-CD3+抗体对脾脏细胞染色，使用流式细胞术分析CD3+、CD8+和MHC-肽四聚体+的细胞群频率。（3）SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体将BirA酶底物序列和PreScission蛋白酶切位点序列分别设计成引物，引物中引入BamHI和XhoI酶切位点，以pcDNA3．0-SCT为模板，通过重叠PCR技术，获得依次含PreScission蛋白酶切位点、SCT和BirA酶底物的基因序列;获得的基因序列用BamHI和XhoI酶后，与同样酶切过的载体pET32c（+）连接;连接产物用电转化法转化大肠杆菌JM109中;先进行抗性筛选，对获得的克隆再进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定，获得重组载体;用化学法将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中;对转化菌落进行培养和用IPTG诱导，分离菌体进行SDS-PAGE电泳分析，表明蛋白以包涵体存在，大小与预期一致;提取包涵体，进行稀释复性;用超滤器浓缩复性产物;复性产物换用PreScission蛋白酶缓冲液，加入PreScission蛋白酶以切除融合表达的标签;酶切产物经SDS-PAGE电泳分析表明大部分蛋白被切开;酶切产物先后经Ni离子亲和层析和GST亲和层析纯化，经SDS-PAGE电泳分析表明获得了纯的目的蛋白;对目的蛋白再进行和MHC-肽四聚体构建的基本方法一样的生物素化等过程，最后得到MHC-肽四聚体。（4）对比分析构建MHC-肽四聚体的两种方法，得出基于SCT构建MHC-肽四聚体的优越性。结果和结论（1）构建了有活性的HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体，可以将其用于检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL。（2）构建了重组载体pSB1，为今后进一步研究SCT-BSP可溶性表达打下了基础。（3）将SCT-BSP构建成了MHC-肽四聚体，其方法相比构建MHC-肽四聚体的基本方法具有方便、快捷、节约成本和适合规模化生产等优势，为MHC-肽四聚体技术改造提供了新思路。3.期刊论文孙万军.徐东刚.艾辉胜.SUNWan-Jun.XUDong-Gang.AIHui-ShengMHC-肽四聚体技术研究进展-军事医学科学院院刊2006,30(5)抗原特异性T细胞在细胞免疫应答中发挥重要作用.MHC-肽四聚体技术是直接检测抗原特异性T细胞的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的重要技术之一.本文就MHC-肽四聚体技术的基本原理、制备方法,以及在病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病等研究领域的应用进展作一综述.4.期刊论文刘霞.卢健MHC-肽四聚体的研究进展-国外医学（免疫学分册）2005,28(6)四聚体技术是一种可直接对抗原特异的T淋巴细胞进行标记的新方法.MHC-肽四聚体可被用于抗原特异的T细胞的表位分析,T细胞的直接分离与克隆,T细胞功能检测以及作为激活T细胞的刺激物和进行原位染色等方面的研究.5.学位论文朴文花MHC-肽四聚体的构建及临床初步应用2004抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)通过识别细胞表面与主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)-I类分子结合的抗原肽而杀伤靶细胞，是机体抗肿瘤、抗移植物及有效控制各种感染的重要免疫防御反应之一。定量分析CTL可为阐明免疫应答的自然发生过程提供重要信息。传统的定量CTL的方法如51Cr释放实验、有限稀释法(limiteddilutionassays，LDA)等需要体外淋巴细胞培养，费时费力，敏感性低。新近开发的由人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)重链和β-2微球蛋白(β-2microglobulin，β-2m)轻链、抗原肽和染料标记的连接蛋白组成的四聚体试剂，具有高敏感性、特异性和高效性等特点，不仅能够直接计数抗原特异性T细胞，还能对其进行表型和功能方面的分析，大大推进了人们认识抗原特异性CTLs在疾病中作用的研究。在四聚体的合成中，首先用基因工程法合成MHC重链和β-2微球蛋白轻链。但迄今为止，国外合成的这两种蛋白均采用化学诱导剂IPTG(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside)来诱导。IPTG诱导蛋白表达不仅价格昂贵、操作繁琐，而且对细胞有较强的毒性，不适合大规模发酵培养。该研究利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)中扩增出HLA-A0201细胞膜外部分和去除信号肽部分的β-2m基因；以RT-PCR产物为模板，利用PCR方法将含有可供识别生物素化位点的15个氨基酸残基序列(substratepeptideforBirA-dependentbiotinylation，BSP)和甘氨酸-丝氨酸接头的序列接在HLA-A0201胞外区的COOH端。分别将HLA-A0201-BSP和β-2m基因克隆入pBV220表达载体进行表达。表达产物经SDS-PAGE电泳分析：分别在大约33kD和12kD处有一新生带，与预期结果相符；经凝胶成像仪分析软件分析，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m的表达量分别占菌体总蛋白的46％和26％；经可溶性分析显示，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m主要以包涵体的形式存在，分别为90％和85％。表达水平与诱导的时间和温度相关。实验表明：最适的细菌生长温度为37℃，在该温度下，大部分表达蛋白以包涵体形式存在；最适诱导温度42℃，且诱导4小时与过夜诱导表达量没有显著性差异。同时为获得目的蛋白的高效表达，在不同表达载体和不同宿主菌中进行了比较，在pET-30a(+).pET-28b(+)，pET-22b(+)，pET-42b(+)和pKKH中，pET-28b(+)表达量最高，其次为pET-22b(+)；而不同宿主菌间表达量并无明显差异。提取表达的HLA-A0201-BSP和β-2m蛋白的包涵体，洗涤、溶解后进行纯化。根据等电点分析，首先采用SSepharoseFF柱，收集穿过峰。再过QSepharoseFF柱，利用NaCl梯度洗脱法收集50mMNaCl所在峰。HLA-A0201-BSP再经Sephadex-G50柱进行脱盐。HLA-A0201-BSP是非可溶性蛋白，只有在β-2m存在下可复性。经分析其纯度为95％左右，浓度为1.5g/L；而β-2m是可溶性蛋白质，脱盐后继续脱尿素。用SephadexG-25柱进一步脱盐脱尿素，尿素浓度由6mol/L降至2mol/L，再以水透析。经分析其纯度为95％以上，浓度为1.2g/L；采用Westernblot法来鉴定HLA-A0201-BSP和β-2m的免疫学性质。杂交结果显示诱导菌泳道中对应HLA-A0201-BSP和hβ-2m分子量处各有一条较强的杂交带，而只加未诱导菌体的泳道没有杂交带。将纯化好的HLA-A0201-BSP融合蛋白、β-2m以及特异性肽(HBV/HCV)折叠复合，形成HLA-A0201-肽复合物，再以BirA酶作用于融合在HLA-A0201蛋白C端BSP(substratepeptideforBirA-dependentbiotinylation)中的赖氨酸残基上，使其生物素化。生物素化的复合体再分别经Sephacryl-300和MonoQ柱进行纯化。该复合物与藻红蛋白标记的亲和素以4：1比例混合而构建成四聚体。用此四聚体标记已分离好的PBMC，在流式细胞分析仪上进行分析。在急、慢性乙肝患者中，抗原特异性细胞毒CD8+T细胞的频数分别为1.84％和0.02％～0.68％，而在慢性丙型肝炎患者中为0.02～0.72％；同时，采用ELISPOT方法检测了抗原特异的IFN-γ分泌CD8+T细胞(个细胞/孔，2×106/ml/孔)。慢性乙肝患者组：特异性肽刺激组99.50±42.08；非相关肽对照组21.09±14.43；自身对照组20.78±12.32；特异性肽刺激组与非相关肽对照组和自身对照组之间存在显著差异(P＜0.01)。慢性丙肝患者组：特异性肽刺激组43.01±22.08；非相关肽对照组6.09±4.43；自身对照组6.2±3.43；特异性肽刺激组与非相关肽对照组和自身对照组之间存在显著差异(P＜0.01)。健康对照组：自身对照组、特异性肽刺激组与非相关肽对照组均在6±4.03之间，且各组之间没