包头医学院微生物学与微生物检验实验指导之实验1 细菌涂片的制备和革兰染色

微生物学与微生物检验实验指导医学技术系微生物与免疫检验教研室微生物学与微生物检验实验的目的要求1．通过实验来验证理论，使课堂效果更为生动，学到的知识更为巩固。2．通过学生亲自动手操作，得到比较全面的微生物学基本操作技术的训练。3．在微生物学实验课的过程中，帮助学生建立无菌观念，掌握无菌操作技术。4．帮助学生熟悉和掌握常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法以及各种临床标本的微生物学检查的基本程序。5．在实验过程中培养学生独立操作、独立思考、分析问题和解决问题的能力。微生物学实验室规则及注意事项一、微生物学实验室规则在进行微生物学实验时，须时刻牢记实验的对象是病原微生物，任何疏忽都可能导致严重的后果，不仅自身有可能被感染，而且有可能将病原微生物传给他人。因此决不能有丝毫侥幸心理，冒任何不必要的危险。迸入实验室时必须遵守下列规则。1．进实验室时必须穿自大衣，离室时脱下反折，白大衣要经常清洗消毒。2．每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒药水泡手。3．书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具、实验指导、笔记等带入后，放在指定的地方。4．每次实验后均用消毒药水擦洗工作台面，并用紫外线灯照射过夜。5．在实验室内不准吃东西、喝饮料和吸烟，不可把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。6．进入实验室后要保持安静，禁止高声谈话，不准打闹嘻笑。7．必须按照老师指定的方法，小心地处理传染性材料、培养物和污染的物质，要正确地使用存放污染器材的各种消毒容器。8．接种环使用前后必须进行烧灼灭菌。9．必须小心地避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告老师，以便及时作适当处理。10．培养物和传染性材料须放在工作台的安全部位，尽可能保持台面的清洁整齐。11．爱护公物，合理使用实验材料和器材，如不慎损坏了某些器具，应及时报告老师，听候处理。12．实验完毕后值日生清理台面，将需培养的标本及时放入培养箱，并打扫地面，关闭水、电、煤气和门窗，带课教师检查合格后方可离开实验室。二、实验室意外的紧急处理办法1．皮肤破损先除去异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂2%红汞或2%碘酒。2．烧伤局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。3．化学药品腐蚀伤若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤中和；强碱腐蚀伤时先以大量清水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和。若受伤处是眼部，经过上述步骤处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1一2滴。4．菌液误人口中应立即吐入消毒容器内，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口；并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。5．菌液流洒桌面将适量2%一3%来苏尔或0.1%新洁儿灭倒于污染面，浸泡半小时后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。6．火警如发生火警疫情时须沉着处理，切勿慌张，应立即关闭电闸和煤气阀门。如酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭火苗。三、实验时的注意事项(一)严格遵循实验指导1．在开始做实验以前，须仔细阅读实验指导，进行独立思考，并根据实际情况，作出实验的具体安排和打算。2.合理安排时间和实验材料，尽量避免出错，力求取得理想的结果。(二)认真完成实验操作1．认真听取指导老师实验前的讲解。2．细心操作，若发现问题，在独立思考分析原因的基础上找老师帮助。3．在自己的实验材料上作好标记，包括班级、姓名、菌名、日期等。4．认真观察自己的实验结果，将其记录在实验报告中（根据需要用彩色笔绘图记录)，并回答实验报告中所有的问题。5．遇到实验结果与理论不符的情况，应仔细分析原因，培养自己独立思考、分析问题和解决问题的能力。实验1细菌涂片的制备和革兰染色目的要求1．掌握革兰染色的原理、方法；2．熟悉细菌涂片的制备。3．学会在在显微镜下观察和描述细菌。器材和试剂1．菌种葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌。2．试剂革兰染色液、生理盐水、擦镜液。3、光学显微镜、载玻片步骤和方法1．涂片制备(1)涂片:取一张洁净载玻片，将大肠杆菌液体培养物直接涂布于载玻片。或先在载玻片上放置一接种环生理盐水，再取固体培养基上少许葡萄球菌或蜡样芽孢杆菌与生理盐水磨匀。涂成lcm×lcm大小的区域，取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色为宜。(2)干燥:涂片最好在室温下自然干燥，或将标本片接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可放在火焰上烧干。(3)固定:干燥后的标本片迅速通过火焰3次。这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉。2．革兰染色（1）原理:1)革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质食量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2)革兰阳性菌等电点(pI2～3)比革兰例性菌(pI4～5)低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固;不易脱色。3）革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。(2)方法:1）初染：滴加结晶紫2～3滴于涂布细菌处，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。2)媒染:滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。3)脱色:滴加95%乙醇数滴。轻轻晃动玻片;使玻片上流下的乙醇液无紫色为止，大约30秒左右(灵活掌握时间)，用流水冲洗，用于。4）复染:滴加稀释石炭酸复红液数滴，染色lmin后用细流水冲洗，甩干。待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油。然后用油镜观察；染色结果:葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性菌，呈葡萄状排列的球菌；变形杆菌染成红色，为革兰阴性菌，单个散在分布的杆菌。影响因素：一是操作因素，涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时应避免菌体过分受热。二是染液因素;所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使乙醇浓度降低而增强脱色能力。三是细菌因素，不同时间的细菌培养物，染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色。而老龄菌染成红色。细菌染色一般用18一24h的细菌培养物。附录革兰染色液配制1．结晶紫染液:称取结晶紫4～8g，溶于100ml95%乙醇中制成饱和液。取20ml饱和液80ml10g/L草酸铵溶液混合即成，过滤后备用。2.卢戈(Lugol)碘液:先将2g碘化钾溶于I0ml蒸馏水中，再加1g碘，待碘全部溶解后再加300ml蒸馏水即成。3.95%乙醇或丙酮乙醇溶液(70m195%乙醇加3Oml丙酮)。4.稀释石炭酸复红液:称取4g碱性复红溶解于100m195%乙醇内，即成碱性复红饱和酒精溶液，吸取lOml饱和液和90m」50g/L石炭酸水溶液混匀即成石炭酸复红液。量取10ml石炭酸复红液加90ml蒸馏水混匀即成。