包头医学院微生物学与微生物检验实验指导之实验8 物体表面乙型肝炎表面抗原的检测

实验8物体表面乙型肝炎表面抗原的检测目的要求熟悉和掌握对物体表面乙肝病毒HBsAg检测的原理和方法，目的是调查和了解物体表面被HBsAg污染的范围及程度，考核物体卫生学及消毒效果等，对于流行病学调查和保护人群健康具有重要意义。器材和试剂1．试剂乙肝五项检测试剂盒(包括预包被反应条、酶结合物、HBsAg的阴阳对照血清、浓缩洗涤液、显色剂（A、B）、终止液、封口胶纸、稀释液)2.其他酶标板、吸水纸、酶标仪、微量移液器、移液头、振荡器、恒温水浴箱等原理：酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种固相酶免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度（A）值的大小进行定性或定量分析。该试验的检测类型有双抗体夹心法、间接法、双位点一步法、竞争法和捕获法等。双抗体夹心法：属于非竞争结合测定，是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本原理是先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤除去其他未结合物；然后加入酶标抗体并温育。使固相抗体抗原复合物与酶标抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物（双抗体夹心），洗涤除去未结合酶结合酶标记抗体；加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。步骤和方法一、样本采集：用棉拭子蘸1%血清磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4），对医院门把手、水龙头和医疗器械等表面涂抹10次，对桌面、样品台、床头柜等用规格板涂抹采样100cm2。将棉拭子浸入1.5ml磷酸盐缓冲液中，带回实验室。将样品置40C冰箱内过夜，取浸出液用酶联免疫吸附实验检测HBsAg。二、检测步骤1.实验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤液作1：20稀释。2.加待测标本：在反应板中加入待测血清每孔50微升，注意应同时做阴性、阳性和空白对照。3.加酶结合物：每孔50微升，空白对照孔不加，充分混匀，置370C温育30分钟。4.洗板：1）手工洗板：取出反应板，甩去孔内液体，在滤纸上拍干。然后用洗涤液注满每孔，静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复5次、拍干。2）洗板机洗板：选择洗涤5次的程序洗板，最后拍干。5.加显色剂：先加显色剂A，每孔50微升；再加显色剂B，每孔50微升，充分混匀，放置370C避光孵育15分钟。6.终止反应：每孔加入终止液50微升，混匀。结果判定1.肉眼观察结果：空白对照和阴性对照不显色（或有颜色变化），阳性对照出现明显的颜色变化，说明实验成立。受检标本显色深于阴性对照者可判为阳性。2.酶标仪判定结果：采用反应底物的最大吸收波长测定各孔吸光度值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此在450nm波长测定吸光度值。以样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）≥2.1时判定为阳性。注意事项1.试剂使用前应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加，注意均匀用力。2.从冷藏环境中取出的试剂盒应置室温平衡30分钟再进行测试，余者应及时封存，置冰箱内贮藏备用。3.冷藏的待检标本需只室温平衡30分钟，再可检测。4．待检标本不可用NaN3防腐。5.洗板时所用的吸水纸请勿反复使用。6.不同批号试剂请勿通用。7.结果判断须在10分钟内完成。8.封片不能重复使用。9.若浓缩洗涤液出现结晶时，请放置370C至溶解。10.夲试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程操作。