北大基础分子生物学课件03生物信息的传递（上）—从DNA到RNA

第三讲生物信息的传递（上）从DNA到RNA基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的昀终目的。FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right)DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链（codingstrand）或称有意义连（sensestrand），另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链（templatestrand）或称反义链（antisensestrand）。图3-1DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系。DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。生物体内拥有三类RNA，即：编码特定蛋白质序列的mRNA；能特异性解读mRNA中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。3.1RNA的转录3.1.1转录的基本过程无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别转录起始通过启动子转录的延伸和终止。图3-2大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示。转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右，被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右。模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiationtranscriptioncomplex,PIC），以保证有效地起始转录。37℃时，转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸，即每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。正常情况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其mRNA的间隔约为2.5分钟，而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。1、什么是DNA的半保留复制？2、DNA复制的生物学意义是什么？3、原核生物中主要有那几种DNA聚合酶？请说出它们的主要功能？4、说出人类细胞中最大的和最小的染色体，它们各有多少bp。5、说出DNA作为遗传物质的最基本特征。6、有什么证据说明染色体可能是由核小体组成的？7、大肠杆菌DNA完全伸展时有多长？8、重叠基因是怎样发现的，是从哪种生物里首次发现的？3.1.2转录机器的主要成分1.RNA聚合酶RNA聚合酶是转录过程中昀关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板。原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成，但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。图3-3大肠杆菌RNA聚合酶的主要成分与功能分析表3-1大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA3.65×1042核心酶核心酶组装，启动子识别。βrpoB1.51×1051核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心。β’rpoC1.55×1051核心酶？11×1041核心酶未知σrpoD7.0×1041σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子α亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点，平均结合常数为2×1011。σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1秒。表3-2大肠杆菌中的σ因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合因子基因功能-35区间隔（bp）-10区σ70rpoD广泛TTGACA16-18TATAATσ32rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54rpoN氮代谢CTGGNA6TTGCA枯草杆菌中有6种不同相对分子质量的σ因子，其中σ55是主要存在形式，出现在营养细胞中，σ29则主要出现在胞子形成阶段，参与胞子形成期基因转录的调控。在大肠杆菌中，昀常见的调控因子是由rpoD基因所编码的σ70。由rpoH编码的σ32是与热休克启动子所控制的基因转录密切相关。由rpoN编码的σ54则参与细胞的氮代谢。由T4噬菌体所编码的σ55能与大肠杆菌RNA聚合酶的核心酶结合，启动T4晚期基因的转录。真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同，对α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。真核生物RNA聚合酶的主要特征：聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基；同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。表3-3真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较酶细胞内定位转录产物相对活性对α-鹅膏覃碱的敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA50%-70%不敏感RNA聚合酶II核质hnRNA20%-40%敏感RNA聚合酶III核质tRNA约10%存在物种特异性2.转录复合物启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex，此时，DNA仍处于双链状态）。然后，封闭复合物转变成开放复合物（opencomplex），聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。对于强启动子来说，从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。图3-4RNA合成的起始开放复合物与昀初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物。除RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与。表3-4真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物蛋白质亚基数亚基的分子量（ku）功能RNA聚合酶II1210-220催化RNA的生物合成TBP138与启动子上的TATA区相结合TFIIA312，19，35使TBP及TFIIB与启动子的结合比较稳定TFIIB135与TBP相结合，吸引RNA聚合酶和TFIIF到启动区上TFIID1215-250与各种调控因子相互作用TFIIE234，57吸引TFIIH，有ATP酶及解链酶活性TFIIF230，74结合RNA聚合酶II并在TFIIB帮助下阻止聚合酶与非特异性DNA序列相结合TFIIH1235-89在启动子区解开DNA双链，使RNA聚合酶II磷酸化，接纳核苷酸切除修复体系一般情况下，转录起始复合物可以进入两条不同的反应途径：合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。转录延伸复合物较为稳定，可长时间与DNA模板结合而不解离。只有在遇到转录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离，释放转录产物并导致聚合酶本身从模板DNA上脱落。3.2启动子与转录起始大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及σ因子的结合与解离。3.2.1启动子区的基本结构启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤。把起点5'末端的序列称为上游（upstream），而把其3'末端的序列称为下游（downstream）。起点为+1，下游方向依次为+2、+3……等，上游方向依次为–1、–2、–3……等等。转录单元（transcriptionunit）是一段从启动子开始至终止子（terminator）结束的DNA序列。启动子区有什么结构特点呢？Pribnow将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44个核苷酸对的DNA片段。序列分析发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列，是聚合酶结合位点，称为Pribnow区，其中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的–35bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于–10bp处的TATA区和–35bp处的TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的结合位点。图3-6大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区–35区–10区……T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100……在真核生物基因中，Hogness等发现类似Pribnow区的Hogness区，在转录起始点上游–25～–30bp处，保守序列为TATAAA，也称TATA区。在起始位点上游–70～–78bp处还有另一