常州工程职院仪器分析测试技术教案2-3紫外-可见分光光度法：工作曲线法定量分析

紫外­可见分光光度法模块之任务3：工作曲线教学任务p能利用可见分光光度计，采用工作曲线法测定样品中某种单一组分的含量并对测定数据进行处理。要求测定结果相对误差小于 2%。教学方法p引探法学时p每 20人一个学习组，一人一台紫外可见分光光度计，整个任务需 6学时。教学设计问题：水中微量铁的测定方法？学生讨论，提出不同的测定方法教师引出紫外可见分光光度法教师展示紫外可见分光光度法测铁的全过程学生带着问题进行实验操作学生完成实验操作问题：如何定量计算教师引导学生采用工作曲线法进行数据处理教师和学生共同讨论解决思考问题并行学习：如何拟定水中微量铬的测定方案？下次任务准备：显色条件、测量条件是如何确定的？课程引入一、确定分析方法p今天的任务就是要测定这瓶水样中的微量铁离子（事先准备一瓶试样，此试样是学生训练过程中的试样，教师已经测过其含量，放在讲台上）问题 1：如何测定水样中微量铁离子？（在上次课结束时即布置并安排学生在课后查阅资料，课堂让学生以 PPT形式展示自己确定的方案，展开讨论与研究。老师在黑板上做总结，将每个方法写下，最后总结各个方法的优劣，用 ppt的形式表现出来）学生通过预先查阅资料，分析各种方法的优劣以及合适与否，教师也可准备一些测定方法，共同讨论各种方法的优劣。测铁的方法类型化学分析方法仪器分析方法方法配位滴定方法氧化还原方法紫外可见分光光度方法原子吸收方法 ICP­AES方法原理控制溶液的酸度（pH=1.8­2.0，用磺基水杨酸做指示剂），重铬酸钾容量法二氮杂菲分光光度法，最大波长510nm 将样品直接吸入火焰中，于波长248.3nm处测量铁基态原子对其空心阴极灯特征辐射的吸收采用电感耦合等离子发射炬为光源的发射光谱。最低检测限 1% 1% 0.05mg/L， 0.0010%­ 1.00% 0.03 mg/L 设疑：测此水样，是选择化学分析法还是仪器分析法？教师总结：化学方法是适用于常量分析（1%）。故选择仪器分析方法。仪器分析测铁的方法方法紫外可见分光光度方法原子吸收方法 ICP­AES 方法原理二氮杂菲分光光度法，最大波长510nm 将样品直接吸入火焰中，于波长 248.3nm 处测量铁基态原子对其空心阴极灯特征辐射的吸收采用电感耦合等离子发射炬为光源的发射光谱。最低检测限 0.05mg/L， 0.0010%­ 1.00% 0.03 mg/L 火焰：10 ­6 g/L；无火焰 10 ­10 ~10 ­14 g/L 相对误差 2%~5% 火焰：1%；无火焰 3%~5% 优点设备成本低，易在企业中进行干扰少、灵敏度高、操作简便、减少化学污染缺点操作步骤繁琐，试剂耗量较设备成本高，样品需预先处理设备成本高大不常用适用范围饮用水中、镁合金中、煤矿水中原油多组分中铁的测定教师总结：从被测物质的浓度和准确度以及经济成本方面考虑，故选择分光光度法测定水中微量铁含量。引出本次课程核心内容“分光光度法测定水中微量铁” 课程引练二、学生实验 1．可见分光光度法测铁操作步骤：（1）配制 1.000mg·mL­1 铁标准贮备溶液，再将其稀释至 10.0μg·mL­1 铁标准操作溶液。（2）分别配制 100 g· L­1 盐酸羟胺溶液 100mL、1.5 g· L­1 邻二氮菲溶液 100mL、 1.0mol· L­1 醋酸钠溶液 100mL 。（3）准备 8个洁净的 50mL比色管；（4）在 6支比色管中各加入10.0μg· mL­1 铁标准溶液 0.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00、 10.00mL；在另 2 支比色管中分别加入 5ml 未知试液。（5）加入1mL100 g· L­1盐酸羟胺溶液，再分别加入2mL1.5 g· L­1邻二氮菲， 5mL 1.0mol· L­1 醋酸钠溶液，用蒸馏水稀释至标线，摇匀；（6）用 2cm吸收池，以试剂空白为参比溶液，在 510nm下，测定并记录各溶液吸光度。 2．实训过程中的思考问题p在铁标准液和试液中加入盐酸羟胺溶液、邻二氮菲溶液、醋酸钠溶液有何现象产生？它们各自的作用是什么？p在配制溶液的时候，未知试液与标准溶液同时配制的目的是什么? p为什么选择试剂空白？其作用是什么？p工作波长为什么选择为 510nm？（要求：每位学生独立完成，合理安排时间。）课程引学三、数据处理p问题：如何定量？Ø 1.利用光吸收定律 A=εb c 直接计算已知：εFe=1.1×10 4 ,b=2cm，λ=510nm cm mol L××-1l请同学们根据公式计算出试样中铁的浓度该水试样中铁的准确浓度为 10.0 μg·mL ­1 。（请同学们将所计算出的试样中铁的浓度上交老师。老师利用计算机进行结果汇总，并进行误差计算，向同学们展示用此方法得到的结果与实际值差别很大。）Ø 2、利用一个标样的含量进行比较计算由光吸收定律：标样：AS=εbcS，对试样，有 Ax=εbcx 两式相比，有 Cx=AxCS/Ax l请同学们选一个标准溶液的吸光度和浓度计算试样的量这种定量方法我们称之为比较法，其特点是操作简单，适用于个别样品的测定，要求所配制标样的浓度与试样浓度相当。（将学生进行分组，每组用不同的标样浓度进行计算试样的浓度，并将结果上传给老师，老师利用计算机进行结果汇总，并进行误差计算，向同学们展示用此方法得到的结果与实际值差别比较小，并发现标样浓度与试样浓度相差很大时，得到的误差较大，两个浓度相近时，得到的误差很小。）Ø 3、利用绘制工作曲线进行计算l由公式 A=εb c，在测量条件一致的条件下(λ、b 不变），吸光度 A与浓度 c呈正比关系，若以 A为纵坐标，以 c为横坐标，可得一条直线。l工作曲线法：工作曲线法又称标准曲线法，它是实际工作中使用最多的一种定量方法。l工作曲线的绘制方法是：配制四个以上浓度不同的待测组分的标准溶液，以空白溶液为参比溶液，在选定的波长下，分别测定各标准溶液的吸光度。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线。l利用工作曲线计算试样中被测组分的含量。计算公式：ρ试=V×ρ标/V 移，l请同学们根据所测铁标准溶液以 A为纵坐标，c为横坐标，绘制相应工作曲线，并根据曲线计算试样中铁的浓度，并对各种结果进行比较。l绘制工作曲线的注意点：（1）绘制工作曲线的随意性会导致线性不好,所得数据计算结果的差别也就大，结果的相对误差也无法控制。示例 1：坐标比例不当示例 2：坐标轴上数据的有效数字不正确。示例 3：工作曲线应为一条直线，不是折线或曲线；工作曲线的绘制时,要注意直线上下两侧的实验点数应相当。（2）工作曲线的正确绘制测定时，为避免使用时出差错，所作工作曲线上必须标明标准曲线的名称、所用标准溶液（或标样）名称和浓度、坐标分度和单位、测量条件（仪器型号、入射光波长、吸收池厚度、参比液名称）以及制作日期和制作者姓名。0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.4500..1..2..3..4..5..6..7..8..9..10系列1图表标题y=0.2064x+0.0019R2=0.99320.0000.1000.2000.3000.4000.50000.511.522.5A线性(A)图表标题-0.100.10.20.30.400.511.522.5A线性(A)多项式(A)（3）使用工作曲线的要点l在测定样品时，为保证显色条件一致，操作时试样与标样同时显色，再在相同测量条件下测量试样与标样溶液的吸光度l为保证测定准确度，标样与试样溶液的组成应保持一致，待测试液的浓度应在工作曲线线性范围内，最好在工作曲线中部。l工作曲线应定期校准，如果实验条件变动（如更换标准溶液、所用试剂重新配制、仪器经过修理、更换光源等情况），工作曲线应重新绘制。l如果实验条件不变，那么每次测量只需带一个标样，校验一下实验条件是否符合，就可直接用此工作曲线测量试样的含量。（4）最小二乘法设工作曲线方程为 y=a+bx x b y n x b y a i ni i n i-=×-=åå== 1 1 2 1 1 ) ( ) )( ( x x y y x x b i n i i i n i---=åå== 2 1 2 1 ) ( ) ( y y x x b i n i i n i--×=åå==g相关系数接近 1，说明工作曲线线性好（5）工作曲线法总结工作曲线法进行数据处理的两种方法：l用作图法绘制标准工作曲线；用最小二乘法确定直线回归方程。l特点是适于成批样品的分析，可消除一定的随机误差四、讨论和总结 1、实验步骤总结配制标准溶液溶液显色测量仪器调试记录数据数据处理报告结果 2、实验过程问题讨论（1）标准溶液制备问题 1：为什么要先配制 1mg·mL­1 铁标液，然后再进行稀释得 10.0μg·mL­1，而不直接配制？p国家标准规定，当标准溶液的浓度低于 0.1mg·mL­1 时，应先配成比使用的浓度高 1～3 个数量级的浓溶液（不小于 1 mg·mL­1）作为储备液，然后再稀释。问题 2：为什么要稀释成10.0μg·mL­1，而不是其他浓度？（1）标准系列溶液的浓度取值要合适；吸光度数值适宜范围为 0.2～0.8 （2）试液的浓度应合适，其点最好处于标准系列溶液的浓度中部。（2）显色过程问题 1：在铁标准液和试液中加入邻二氮菲溶液、盐酸羟胺溶液与醋酸钠溶液的作用是什么？p邻二氮菲的作用：显色剂当水溶液中的铁含量很低时，溶液本身的颜色很浅，此时无法直接利用可见分光光度法对溶液中的铁进行分析测定。加入 2mL1.5 g·L­1 邻二氮菲溶液后，溶液中的 Fe2+将与其反应生成桔红色化合物，这样就可以用可见分光光度法测定了。邻二氮菲称之为显色剂，其作用就是与无色的待测离子发生化学反应，生成有色的化合物，便于用可见分光光度法进行测定。l显色反应－－将有色物质转变为有色化合物的反应。应考虑下面几个因素：（1）选择性好。（2）灵敏度高。（3）组成恒定，化学性质稳定。（4）如果显色剂有色，要求有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大。对比度△λ 60nm （5）显色条件要易于控制，保证再现性。p盐酸羟胺与醋酸钠的作用l盐酸羟胺的作用是将溶液中的 Fe3+还原成可与邻二氮菲反应的 Fe2+ ，便于测定溶液中总铁含量。l醋酸钠溶液的作用是作为缓冲剂，调节溶液合适的 pH，以保持邻二氮菲显色剂的稳定性。问题 2：在显色操作时，未知试液与标准溶液同时显色的目的是什么? l保证显色条件一致（3）测量过程问题 1：为什么选择试剂空白？其作用是什么？l试剂空白就是指参比溶液的组成是除试样以外的显色液，配制方法是不加试样，其它各种试剂照加，如显色剂、还原剂、缓冲液及溶剂等。l本次测定所用的各种试剂均无色，在测定工作波长下均不会产生明显的吸光度，考虑到各种试剂还会对吸光度有微小的贡献，因此选择试剂空白。l试剂空白与参比溶液所起的作用完全是一样的，即消除各种试剂对吸光度的贡献，使测定过程中产生的吸光度仅仅与被测离子有关，便于直接利用光吸收定律，并能在理论上确保得到准确的结果。问题 2：工作波长为什么选择为 510nm？l因为在此波长下，能得到待测元素与显色剂反应物的最大吸光度，即该波长往往是最大吸收波长。l分光光度分析中，选择最大吸收波长可以得到最高的灵敏度，也能得到较低的相对误差。问题 3：正确使用比色皿l正确选择比色皿的厚度，使吸光度落在合适的范围内；l测量中，要用所测试液润洗比色皿。并行学习拟定方案问题：结合本实验，请完成工作曲线法测定水中微量铬的分析方案，并利用课余时间在实训室完成相关操作。提示：方案设计从可见分光光度法的原理着手，考虑两个过程：显色过程与测量过程（1）显色过程应考虑的问题有l显色剂种类、用量；l溶液酸度；l显色温度和时间；l溶剂选择；l干扰消除。（2）测量过程应考虑的问题有l入射光波长l参比溶液l吸光度测量范围下次任务准备课后作业：水中微量铁测定的方案中显色条件、测量条件是如何确定的？