常州工程职院仪器分析测试技术课件5-4高效液相色谱法：外标法测定叶酸片中叶酸含量

任务4外标法定量î液相色谱分析法模块之p完成叶酸片中叶酸含量的测定p能进行定性定量分析î能力目标p常用的方法是化学分析法、液相色谱法（内标法和外标法）p叶酸是人体必须的一种物质，它能促进胎儿脑神经的发育，也能防止人体贫血，你能设计一可行的分析方案，检测某药厂的叶酸片中的叶酸的含量吗？î课程引入p本项目采用外标法测定叶酸片中叶酸的含量p叶酸片是药物制剂，除了主成分外，还含有大量的淀粉、糊精等辅料，因此样品处理非常重要。î样品的预处理技术p样品预处理的目的是消除基质干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。预处理的过程一般包括：Ø提取经典的方法有均质提取法、振荡提取法、索氏提取法等。Ø净化比较传统的净化手段有液液萃取和固相萃取等，目前比较先进、实用的处理技术凝胶渗透色谱、基质固相分散技术、分子印记技术等也得到了比较广泛的应用。Ø浓缩常见减压蒸馏和气流吹蒸两种方式î样品的预处理技术(续）Ø衍生化所谓衍生化，就是将用通常检测方法不能直接检测或检测灵敏度比较低的物质与某种试剂（即衍生化试剂）反应，使之生成易于检测的化合物。按衍生化的方法可以分为柱前衍生化和柱后衍生化。按生成衍生物的类型又可分为紫外-可见光衍生化、荧光衍生化、拉曼衍生化和电化学衍化。衍生化技术不仅使高效液相色谱分析体系复杂化，而且需要消耗时间，增加分析成本，有的衍生化反应还需要控制严格的反应条件。因此，只有在找不到方便而灵敏的检测方法，或为了提高分离和检测的选择性时才考虑用衍生化技术。î测定过程演示1p配制流动相：Ø磷酸二氢钠缓冲液：取磷酸二氢钠6.80g，加水880mL，振摇使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH＝6.30±0.05Ø把磷酸二氢钠缓冲液和甲醇以80∶20的比例混合，用0.45μm有机相滤膜减压过滤，脱气。p色谱分离条件：Ø色谱柱：C18色谱柱（5μm,4.6mmi.d.×250mm）Ø波长：254nmØ流速：1.0mL·min-1。。î测定过程演示2p标样及试样配制Ø叶酸标准品：精密称取0.01g叶酸对照品，置50mL容量瓶中，加30ml0.5%的氨水溶解，再用纯水定容至刻度。Ø叶酸试样（5mg/片）：取叶酸片40片，精确称量，研磨至均匀，精确称取二片重量的叶酸粉未于50ml的容量瓶中，加入30ml0.5%氨水，在热水浴中振摇20分钟，冷却后用纯水定容至刻度，摇匀，过滤。p打开检测器、高压泵的电源开关，按上述分离条件设置参数；打开排放阀，“purge”1-2分钟，关闭“purge”，使仪器在设定的条件下平衡。p打开工作站，设置分析方法。p等基线平衡后，用微量注射器量取定量环体积的3-5倍的叶酸标样，在上述分析条件下进样。p在相同的条件下，对叶酸样品进行测定，记录标样与样品的色谱峰面积和保留时间。p记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果î测定过程演示3p叶酸的定性问题：一般可采用标准物质进行保留时间的对照来定性。p在标样和试样溶液的配制过程中，称量需采用减量法。p本项目中叶酸的定量采用外标法。p色谱柱的个体差异很大，即使是同一厂家的同种型号的色谱柱，性能也会有差异。因此，色谱条件（主要是指流动相的配比）应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。p本项目的测定需使用电炉，操作时要注意用电安全；同时配制氨水溶液应在通风柜中进行。î学生实训p要求每位学生独立完成，独立处理数据，合理安排时间。î外标法定量外标法的特点：操作、计算简单，是一种常用的定量方法。它无需各组分都被检出、洗脱。但需要标样，标样及未知样品的测定条件要一致，进样体积要准确。î外标法实例用液相色谱法测定叶酸片（5mg/片）中叶酸含量。称取对照品5mg，加30ml0.5%氨水溶解，用水定容至50mL，20uL进样得叶酸峰面积为92800；另取已研成粉末的叶酸片剂91.5mg，同法测定得叶酸峰面积为91750，求叶酸片剂的百分含量。（已知平均片重为92.2mg）î分析中的污染p一般检测的环境、容器、试剂都是影响测定结果的因素。Ø容器实验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等，在进行分析时，应按照待测样品的要求来选则器皿，不管使用哪种器皿，容器的洗条清洁都是很重要的，也是取得好的检测结果的基本保证。Ø试剂在液相色谱分析中，所选用的试剂必须是色谱纯、优级纯或分析纯，如果用含量有杂质的试剂，则会出现杂峰而影响测定结果。Ø环境污染仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染，影响检测结果，这种污染很难校正。因此，仪器室与其他实验室应隔离，保持清洁，仪器室内应安装空调，注意防潮、防腐、防震、空气相对湿度应小于70%为宜î仪器维护p仪器的性能影响到分析的结果，因此，我们要及时维护仪器。Ø贮液器流动相在使用前都应用0.45μm的滤膜过滤，以保持贮液器的清洁；要定期清洗贮液器，以防滋长微生物。Ø高压输液泵所用流动相或溶剂均过滤和脱气；开泵时应放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中Ø进样器进样前应使样品混合均匀，无可溶解的污染物，以免堵塞六通阀；液相进样针应为平头针；每次工作结束后应冲洗整个系统；以防止缓冲盐和其它残留物留在进样系统中，。Ø色谱柱①在进样阀后加流路过滤器（0.5μm烧结不锈钢片），挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒。②在流路过滤器和分析柱之间加上“保护柱”，收集阻塞柱进口的来自样品的降低柱效能的化学“垃圾”。③色谱柱应在要求的pH值范围和柱温范围下使用，应使用不损坏柱的流动相。④进样前应将样品进行必要的净化，以免进样后对色谱柱造成损伤。⑤每次工作结束后，如果流动相是水和有机溶剂系列，则用流动相冲洗30分钟左右；如果流动相中含有盐溶液，则先用水-甲醇（90∶10）然后再用纯甲醇冲洗20分钟并保存。î仪器维护î下次课程问题p液相色谱是如何实现十八种氨基酸（混合物）的分离？（查阅资料，建议参考气相色谱理论）