复旦基因组学课件10-2表观遗传与胚胎干细胞

表观遗传与胚胎干细胞人类皮肤细胞诱导成胚胎多能干细胞美日两国研究小组2007年11月20日分别在两家权威科学杂志发表相关研究报告,宣称成功将人类皮肤细胞诱导成多能干细胞,即iPS(inducedpluripotentstem)。2010年Sience杂志将该项研究成果列为当年十大科学进展之一.俞君英在汤姆森实验室内进行有关干细胞的试验人类iPS细胞的培育过程1)筛选与克隆控制胚胎干细胞基因组重新程序化的基因.2)把4种基因注入皮肤细胞，这些特定基因能够“重构”皮肤细胞的基因.3)将普通人体皮肤细胞成功改造成干细胞.4)理论上讲，这种干细胞的功能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干细胞，能够最终培育成人体组织或器官.灵长类胚胎干细胞ThomsonJA对灵长类胚胎干细胞所给出的定义如下:1)来自未植入子宫之前的胚胎;2)可以无限保持未分化及增生状态;3)即使在培养之后仍然可以稳定地发育成胚胎的三个胚层,具有多向分化的潜能.见:Science282,1998胚胎的特征及发育囊胚期内细胞团为多能干细胞.全能性干细胞所应具有的特征1)来源于一个全能性的细胞群体;2)具有正常的细胞核型;3)具永生性,在胚胎状态下能无限制的分裂;4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所有3种胚层的体细胞此前所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。体细胞可以逆转成为胚胎干细胞1)就基因组的遗传信息组成而言,每个体细胞都具备潜在的发育成所有组织细胞的潜能.2)因为体细胞是胚胎发育与形态建成的终极产物,自然状态下这是一个不可逆的过程3)胚胎发生与细胞分化是基因组程序化的结果,体细胞要逆转为胚胎干细胞必需重新程序化.4)因体细胞核移植到卵细胞中可以获得类似自然受精发育的胚胎,在卵细胞中必定存在使基因组重新程序化的因子.5)将基因组重新程序化的因子导入体细胞可以使体细胞命运逆转,产生具有多能分化的干细胞.几个关键的步骤1)基因组重新程序化基因的筛选2)基因组重新程序化基因的转化3)转化细胞的筛选与鉴定4)iPS细胞的功能验证常规胚胎干细胞的获取及培养诱导哺乳动物体细胞转变为多能胚胎干细胞1)根据核移植可以判断卵细胞中含有促使体细胞基因组重新程序化的因子.2)胚胎干细胞可以持续维持多能分化的潜力,表明有控制胚胎干细胞属性(identity)的遗传因素.3)分离鉴定与胚胎干细胞生成与维持的基因是逆转体细胞程序化的前提.寻找决定胚胎干细胞命运的基因1)Yamanaka等选择24个在胚胎干细胞和肿瘤细胞中表达上调的基因作为胚胎干细胞命运决定候选基因.2)将上述基因构建到逆转录病毒表达载体中,它们处于Fbx15基因的调控顺序下游,并将它们转化老鼠胚胎成纤维细胞(MEF).3)Fbx15基因是胚胎干细胞专一性表达的.4)实验结果证实单个外源基因的导入不能获得胚胎成纤维细胞的逆转,但组合的转化可产生具有胚胎干细胞形态特征的细胞,这些细胞被称为iPS(inducedpluripotentstem)细胞.见:Cell126:663-676,2006胚胎干细胞命运决定基因筛选策略胚胎干细胞决定基因的筛选1)上述小组在10个基因组合产生MEF细胞逆转的基础上,采取排除法确定4个基因为MEF细胞逆转所必需,分别为:Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc.2)在这初筛的4个基因中任意缺失一个基因,均不能产生类胚胎干细胞的特征.因此这4个基因是最低要求的逆转MEF细胞的因子.3)Oct3/4,Klf4,Sox2和c-Myc四个基因转化的MEF细胞可促使Fbx15和Nanog基因的表达.4)Fbx15和Nanog基因的表达可作为筛选iPS细胞的标记.基因组DNA甲基化的延伸修饰1)在人体和老鼠细胞以及胚胎干细胞的DNA修饰调控研究中,近年来发现存在其它的DNA甲基化延伸修饰的现象.DNA碱基中5-甲基胞嘧啶称为第5种碱基(5-mC)，5-羟甲基胞嘧啶(5-Hydroxy-methylcytosine,hmC)称为第6种碱基,5-甲酰胞嘧啶(5-formyl-cytosine,5-fC）称为第7种碱基,5-羧基胞嘧啶(5-carboxyl-cytosine,5caC)称为第8种碱基.2)上述DNA碱基的延伸修饰涉及TET蛋白家族,有三个成员.3)DNA碱基的延伸修饰与细胞分化及癌变有关.见:Nanog基因的表达可作为筛选iPS细胞的标记胚胎干细胞的分化涉及干细胞的更新和分化两个同时发生事件,它们在一个分裂的细胞内各自发生.现有的一些证据表明,DNA的5-羟甲基胞嘧啶与细胞命运的决定有关.见:MohrF等,ExperimentalHematology,2011,39:272-281.iPS细胞功能的验证1)iPS-MEF细胞系具有类似天然胚胎干细胞的形态特征.2)iPS-MEF细胞系的Oct3/4和Nanog基因的启动子区核小体组蛋白的乙酰基化和K9的甲基化以及CpG双碱基甲基化模式与胚胎干细胞类似.3)iPS-MEF细胞系的DNA芯片杂交检测基因表达譜也与胚胎干细胞类似.4)将iPS-MEF细胞系注入到裸鼠皮下细胞可产生畸胎瘤,表明具有胚胎干细胞特征.iPS-MEF具多向分化潜能将iPS-MEF转化细胞注入到裸鼠皮下组织后可产生的畸胎瘤含有不同的组织细胞,具多向分化潜能.逆转的老鼠胚胎成纤维细胞具多向分化潜能Nanog更适合iPS细胞筛选因为以Fbx15为标记筛选的iPS-MEF与天然老鼠囊胚混合后不能生成嵌合成体,其胚胎干细胞潜能竞争力差.实验证明Nanog更适合.Nanog更适合iPS细胞筛选以Nanog为标记的筛选可获得具有细胞增生的iPS及畸胎瘤分化的胚胎干细胞.转化人类皮肤细胞为胚胎干细胞Yu等的研究如下:1)选择14个涉及胚胎干细胞形成与维持相关的基因构建到逆转录病毒载体中转化体细胞.2)根据不同的基因组合转化体细胞为胚胎干细胞效果,确定4个基因即Oct4,Sox2,Nanog和Lin28足以转化体细胞为胚胎干细胞.3)由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验证.由人类皮肤体细转化为胚胎干细胞的验证1)iPS细胞具有人类自然胚胎干细胞的形态.2)iPS细胞具有正常的核型.3)具端粒酶活性.4)细胞表面膜蛋白标记与自然胚胎干细胞相同.5)基因表达譜相一致.6)Oct4启动子甲基化模式与自然胚胎干细胞相似.7)具有发育成三胚层细胞的潜能,来自iPS细胞的畸胎瘤可分化为多种组织细胞.畸胎瘤的分化iPS细胞系接种到裸鼠肌肉组织产生畸胎瘤并分化出不同的组织细胞:左,神经细胞,内胚层发育;右,肠道细胞,内胚层发育.iPS细胞具有癌症倾向1)iPS细胞可与天然小鼠胚胎囊胚期细胞混合并参于胚胎发育长成成年个体.2)含有iPS来源的小鼠个体有一定的比例产生癌症.3)产生癌症的原因:1,LTR载体的影响;2,c-Myc基因具有癌变的潜能.4)路漫漫其修远兮,……….产生iPS细胞的多种方法NatureBiotechnology,26:1246,2008干细胞重新程序化方法比较